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[期刊] 中国水产科学
[作者]
张高峰 郭彤 魏华 马珂
以Ⅳ型胶原酶消化法分离鲫(Carassius auratus)肝细胞,然后将其分成2组,一组不再经过进一步处理(即对照组);另一组再用Percoll液密度梯度离心纯化肝细胞(即实验组),然后将2组细胞接种于DMEM/F12培养基中培养10 d。在倒置显微镜下观察2组肝细胞的形态并绘制细胞生长曲线;采用台盼蓝染色法比较2组肝细胞的存活率;通过HE染色法在光镜下检测肝细胞的纯度;采用MTT比色法测定2组肝细胞的增殖率;收集肝细胞培养上清液检测白蛋白、尿素以及乳酸脱氢酶的水平以检测2组肝细胞功能。结果表明,对照组鲫肝细胞存活率为80.6%,纯度为83.2%;实验组肝细胞存活率和纯度明显高于对照组(P...
关键词：
鲫 肝细胞 分离 纯化 Percoll法
[期刊] 华北农学报
[作者]
贾睿 曹丽萍 丁炜东 杜金梁 徐跑 殷国俊
通过不同的分离方法和培养条件探索鲫鱼肝细胞的原代培养,以建立稳定的鲫鱼肝细胞原代培养模型。用台盼蓝染色检测细胞存活率;用WST-1检测细胞活力,同时观察长期培养过程中肝细胞的形态变化。结果显示:组织块培养4～5 d后肝细胞从组织块中迁出并增殖,但这种方法所需时间长且细胞不易收集;机械分散法收集的细胞少,细胞存活率低;而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的分离和培养效果。用0.1%胰蛋白酶消化30 min,每克肝重可收集1.47×108个细胞,平均存活率为91.43%。培养基和血清浓度均会影响肝细胞的贴壁和生长。在含有10%(V/V)胎牛血清(FCS)M199培养基中,4%CO2、28℃,肝细胞培养8～...
关键词：
鲫鱼 肝细胞 胰蛋白酶 原代培养
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
韩雅婷 杨学义 徐小明 史明艳 窦忠英
采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。
关键词：
表皮干细胞 分离 培养 鉴定
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孔庆学 张涌
采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。
关键词：
未成年大鼠 睾丸支持细胞 分离纯化
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
薛振华 刘国世 史建民 王梁 田秀芝 王永彬 侯保民 田见晖 曾申明 朱士恩
对达兰仔猪睾丸精原细胞及精原干细胞进行了体外分离、纯化和初步鉴定。对8 d达兰仔猪的睾丸实质组织,采用Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶和胰酶组合消化法分离精细管细胞,制备单细胞悬液,用Percoll不连续密度(11%、19%、27%、35%和43%)梯度法纯化精原细胞;对纯化后的细胞培养12 h,细胞贴壁后进行碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定,初步确定精原干细胞及其比例。结果表明:所获精细管细胞悬液中活细胞和死细胞所占的比率分别为92.65%和7.35%,平均每克睾丸可获得4.17×107个细胞;精原细胞主要分布于19%~27%的Percoll梯度带中,经纯化后其纯度为47.62%,精原干细胞占该带细胞的比...
关键词：
达兰猪 精原干细胞 分离 纯化 精原细胞
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
穆杨 张彦明 童德文 王玉东 李崴 李玉清 郑增忍
将培养收获的M SB 1细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次后,调整细胞浓度为2×106/mL,然后每毫升细胞悬液加2 IU木瓜蛋白酶和1 mm o l/L的L-胱氨酸溶液0.1 mL,混匀后37℃作用1 h以分离M SB 1细胞表面M AT-SA。对木瓜蛋白酶处理前后的M SB 1细胞进行间接荧光抗体染色以检测M ATSA的分离情况。获得的M ATSA粗提物经超滤浓缩和Sephadex G-75凝胶纯化后,用SDS-PAGE检测纯化的结果。试验结果表明,从M SB 1细胞表面分离到M ATSA,经电泳获得了纯化的M ATSA,其相对分子质量约为35 ku。结果为M ATSA单克隆抗体的制备及其相关的研...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
唐雪 马海田
剪切9日龄三黄肉鸡鸡胚肝组织,胰酶消化分离肝细胞,用改良的M199培养液进行培养。结果显示,分离的肝细胞即时存活率为93.7%±2.6%;过碘酸席夫试剂染色后,胞质中布满粉红色糖原颗粒;肝细胞活力和白蛋白分泌功能在第3天达到最高水平,这是体外研究禽类肝脏功能和代谢的最佳时机。
关键词：
鸡胚肝细胞 原代培养 形态 功能
[期刊] 水产学报
[作者]
骆源 张春晓 王玲 张冬玲 霍振华 宋凯
本研究以斜带石斑鱼肝细胞为实验对象，在不同培养条件下进行原代培养，旨在探讨稳定可靠的斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法。采用组织块分离法和胰蛋白酶（含ＥＤＴＡ）消化法分离肝细胞，并通过密度梯度离心法分离纯化肝细胞，细胞悬液于ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｍ１９９和Ｌ－１５培养液中培养；细胞活力及数量采用血球计数板计数，并通过ＭＴＴ法测定细胞增殖率；同时，测定不同时间培养上清液中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性、白蛋白（ＡＬＢ）和尿素氮（ＢＵＮ）的含量，以分析肝细胞生长状态。结果表明，组织块方法不适于斜带石斑鱼肝细胞的培养，未见细胞从组织块中迁出，而胰蛋白酶消化法获得良好稳定的培养效果，细胞产量达到１．６×１０８．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
卢荣华 张文雅 张玉茹 杨丽萍 王俊丽 孟晓林 聂国兴
外泌体是具有磷脂双分子膜结构的纳米级囊泡,能够参与机体多种生理过程。实验探讨了草鱼肝细胞外泌体的分离鉴定方法,并初步研究外泌体对草鱼肝细胞中miRNAs及免疫相关基因表达的影响。实验以草鱼肝细胞L8824为材料,通过超速离心获得外泌体,利用电子显微镜观察外泌体形态,采用纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术检测外泌体粒径和数量,同时利用Western blot分析其标志蛋白CD63的表达,最后用正常肝细胞和油酸诱导的脂肪肝细胞源外泌体孵育草鱼肝细胞,通过Real-time qPCR技术检测两种不同来源的外泌体对草鱼肝细胞中miR-122/33及免疫相关基因(TNF-α,NF-κB,IL-1β,IL-6和IL-10)转录水平的影响。结果显示,草鱼肝细胞外泌体为30～150 nm的不均匀囊泡,呈圆形或椭圆形,有完整的膜结构;外泌体标志蛋白CD63呈阳性表达;NTA技术检测显示外泌体囊泡占所有囊泡的50%以上;脂肪肝细胞源外泌体显著提高了肝细胞中miR-122及炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA转录水平。研究表明,通过超速离心法可成功分离草鱼肝细胞外泌体,且脂肪肝细胞源外泌体在草鱼肝细胞免疫调节中可能发挥重要作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
马云鹏 韩胜芳 陈琰 王冬梅
【目的】在已经证明小麦与叶锈菌互作的小麦细胞间隙液(IWF)中存在具有蛋白质性质的激发子活性物质的基础上,以期通过试验得到激发子的纯品制剂,为进一步研究激发子的组成和结构、激发子受体以及寄主产生过敏性反应的信号转导机制提供基础条件。【方法】提取叶锈菌小种165侵染的小麦品种洛夫林10细胞间隙液,通过盐析、凝胶过滤柱层析和离子交换柱层析等分离纯化技术,对IWF中具有激发子活性的蛋白质组分进行分离纯化。【结果】分离出能诱导洛夫林10健康叶片PAL、PO活性增高并诱发洛夫林10悬浮细胞程序性死亡的激发子活性组分。该组分经SDS-PAGE电泳呈现单一条带,分子量约为32kD。【结论】经硫酸铵分段盐析、...
[期刊] 水产学报
[作者]
吴婷婷 魏华 郭敏 曹娜 李国鹏
研究了镉诱发鲫肝细胞相关的胞内游离钙离子变化,以及Ca2+-ATP酶及金属硫蛋白表达量的变化。试验分为对照组、5、10、15、20μmol/L CdCl25个组。Ca2+用Fura-2/AM方法检测,试验后24 h用荧光倒置显微镜观察细胞内游离钙离子变化;分光光度法检测Ca2+-ATP酶;石墨炉—原子分光光度法检测了细胞内镉离子浓度;免疫酶联法(ELISA)检测了金属硫蛋白(MT)含量。结果显示,镉可导致细胞存活率下降,具有一定的毒性。镉离子引起胞内Ca2+荧光强度和Ca2+-ATP酶活性增加(P<0.01)。随镉浓度升高,处理组Ca2+-ATP酶浓度活性分别是对照组的4.52、6.73、6....
[期刊] 中国农业科学
[作者]
汪纪仓 刘学忠 袁燕 裔传卉 卞建春 刘宗平
【目的】探讨氧化应激在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的作用。【方法】采用两步灌流法获得大鼠肝细胞,经过24 h培养,用醋酸镉处理细胞,或者Z-VAD-fmk、NAC和镉共同处理细胞。应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞内ROS水平和线粒体膜电位,分光光度法检测caspase-3活性、GSH和MDA含量。【结果】结果表明,肝细胞暴露于浓度为2.5、5、10μmol.L-1的镉后,细胞相对存活率显著下降(P<0.01),凋亡率显著或极显著升高(P<0.05或P<0.0...
关键词：
镉 大鼠肝细胞 细胞凋亡 氧化应激
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓放明 龚淑俐 赵荣 杨伟丽
冠突散囊菌液体深层发酵滤液经浓缩,醇析,透析冻干得多糖粗品.粗多糖经Sevag法脱蛋白,DEAE-52阴离子交换柱层析纯化得到4种多糖.将含量最高的多糖ECP-A经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析得到纯化的冠突散囊菌胞外多糖(ECP-A1和ECP-A2),并测定其相对分子质量.用紫外光谱和红外光谱分析鉴定该多糖,紫外光谱分析未见蛋白质(280 nm)与核酸(260 nm)的特征吸收峰,红外光谱揭示ECP-A1具有典型的多糖特征吸收峰,表明ECP-A1和ECP-A2为单一均匀组分的多糖.
关键词：
冠突散囊菌 胞外多糖 分离 纯化
[期刊] 水产学报
[作者]
卓梅琴 谭肖英 黄超 胡伟 朱庆玲
采用Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE Sepharose离子交换、Sephadex G-25凝胶过滤等方法对黄颡鱼肝脏胞质中NADP依赖性的异柠檬酸脱氢酶(IDPc)进行纯化,并研究其相关的酶学性质。结果显示,IDPc的比活力为7.94 U/mg,亚基分子量为36.7 ku。IDPc活性最大时的pH和温度分别为8.0和65℃,活化能为81.33 kJ/mol,底物米氏常数KmNADP和KmIC分别为0.056和0.175 mmol/L,底物最大反应速率VmNADP和VmIC分别为9.04和10.51U/mg,催化效率KcatNADP和KcatIC分别为0.16和0.06 min/...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
曹少谦 潘思轶 姚晓琳 傅虹飞
【目的】研究适合分离纯化血橙花色苷的柱层析法,并对血橙中的花色苷进行初步鉴定。【方法】分别采用12种不同类型树脂对血橙花色苷静态和动态吸附解吸试验进行比较,优化了大孔树脂提取分离血橙花色苷的工艺,采用Toyopearl TSK HW-40S柱层析对血橙花色苷提取物进一步分离纯化。同时,利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用(HPLC-ESI/MS)对血橙花色苷进行定性分析。【结果】大孔树脂NKA-9对血橙花色苷的分离效果最好,最佳工艺条件为:50%乙醇用柠檬酸调pH为2.5时洗脱效果最好;ToyopearlTSKHW-40S柱层析分离纯化条件为:35%甲醇(经2%甲酸酸化)为洗脱液,流速0.6ml·...
关键词：
血橙 色素 花色苷 纯化 鉴定
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