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[期刊] 中国农业科学
[作者]
金鑫 张曼 范燕茹 王佩 杨银凤
【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的调节作用,为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新鲜的绵羊瘤胃组织用PBS和抗生素处理后进行瘤胃上皮细胞原代培养,当原代细胞数量长到细胞培养瓶的85%以上时,将细胞传于12孔板用于细胞刺激试验。同时将活化并纯化后的酿酒酵母菌25℃、180 r/min有氧培养48 h后,进行5次平行平板计数试验,根据平板计数的数据处理方法,得到浓度为5.2×108 CFU·m L-1的酿酒酵母菌液,再通过倍比稀释把所得菌液依次稀释成浓度为5.2×...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
包图雅 曹贵方 凃勇 杜晨光
【目的】探讨17β-雌二醇(E2)上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2表达的可能信号通路。【方法】分离培养绵羊输卵管上皮细胞,将第2代输卵管上皮细胞分为E2(10-8 mol/L)组、雌激素受体拮抗剂ICI182780(10-7mol/L)组、PKA阻断剂KT-5720(1μmol/L)组、PKC阻断剂H-7(50μmol/L)组、NF-κB阻断剂PDTC(50μmol/L)组及空白对照(Control)组,在不同阻断剂组加入各自阻断剂干预绵羊输卵管上皮细胞1h后,在各阻断剂组和E2组中再加入10-8 mol/L 17β-雌二醇培养6h,然后采用实时荧光定量RT-PCR方法检测各组SBD-2mRN...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
姜茂成 詹康 贡笑笑 赵国琦
为研究不同pH和短链脂肪酸(SCFAs)对奶牛瘤胃上皮细胞SCFAs转运蛋白和G-蛋白偶联受体41(GPR41)表达影响,设计6组试验,每组3个重复,培养24h之后,收集细胞提取细胞总RNA。结果表明:在添加SCFAs条件下,pH 6.2、6.8和7.4之间的MCT1表达量差异不显著(P>0.05);pH 6.8且添加SCFAs条件下,MCT1的表达量显著高于缺乏SCFAs pH 6.8和7.4试验组(P<0.01),MCT4的表达量显著高于缺乏SCFAs(P<0.01),NHE1、NHE2和NHE3表达量显著高于缺乏SCFAs时的表达量(P<0.01);随着pH的降低,NHE1、NHE2和NHE3的表达量逐渐上调,而在缺乏SCFAs条件下,GPR41不表达;在添加SCFAs之后,显著激活了GPR41的表达。研究发现SCFAs能够显著加强奶牛瘤胃上皮细胞SCFAs转运蛋白和GPR41的表达量,从而证明细胞对SCFAs的吸收主要依赖于SCFAs转运蛋白和GPR41。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张梁 石贵阳 王正祥 章克昌
采用基因敲除技术,在工业酿酒酵母染色体DNA上的甘油代谢途径关键酶基因GD P 1中,整合入来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因bgⅡl,通过提高G 418浓度筛选得到多拷贝整合子。结果表明,整合子利用纤维二糖的能力得到提高,产甘油能力下降,外源基因表达稳定;引入外源基因后,其对酵母增殖能力没有大的影响,仅形态发生变化;在以微晶纤维素为原料,结合纤维素酶发酵时,与亲代工业酿酒酵母相比,发酵液乙醇浓度最高增加69%。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
卢劲晔 卢炜 刘静 陆江 翟晓虎 沈赞明
通过体外试验研究胰岛素样生长因子1(IGF-1)对山羊瘤胃上皮细胞增殖的影响,胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)以及受体后信号转导途径在此过程中所起的作用。试验采用IGF-1、IGF-1R抑制剂分别处理体外培养的瘤胃上皮细胞,研究IGF-1对瘤胃上皮细胞增殖、细胞周期蛋白表达及增殖相关信号转导途径中关键蛋白的活化水平;并用添加胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂、蛋白激酶-B(AKT)抑制剂处理,研究增殖相关信号转导途径在IGF-1诱导瘤胃上皮细胞增殖中的作用。结果表明:IGF-1显著提高体外培养瘤胃上皮细胞3H-TdR掺入率(P<0.05...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘延琳 李华
【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌SD-2a(Oenococcus oeni SD-2a)的苹果酸-乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺...
[期刊] 水产学报
[作者]
胡澄溪 刘伟 毕燕会 周志刚
三酰甘油（TAG）合成缺陷型酿酒酵母突变株H1246常用于其他生物二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）的基因功能鉴定。为了解外源DGAT的基因表达对酵母细胞脂质及生长的影响，实验将缺刻缘绿藻1个I型和3个II型的DGAT分别转化H1246菌株，经筛选获得tDGAT1、tDGAT2A、tDGAT2B及tDGAT2C等4株转目的基因酵母。通过显微观察、分光光度法、重量法、棒状色谱分析、气相色谱-质谱分析对酿酒酵母的形态和脂滴、细胞密度、生物量、总脂、总脂肪酸以及TAG含量进行检测。稳定生长期时的显微观察结果显示，这4个外源基因均能使H1246菌株恢复TAG的合成和贮存能力进而在细胞中出现油滴；油脂分析结果表明，tDGAT1菌株的TAG及脂肪酸含量最高，且显著高于野生型Scy62及其他3株转目的基因菌株的水平；生长性能的数据显示，4个外源基因均能使H1246菌株的细胞密度达到Scy62的水平，这可能是由于TAG的合成消耗了游离脂肪酸，以减轻其对细胞产生的伤害而致；但tDGAT1菌株的生长迟滞期明显延长，以致其生长速率最低。本研究结果表明，将缺刻缘绿藻不同类型的外源DGAT转化酿酒酵母后，使后者的生长性能及脂质含量产生不同的变化。该结果为利用基因工程改造酵母菌株以生产人类所需要的目的油脂研究奠定了基础。
[期刊] 草业科学
[作者]
占今舜 霍俊宏 詹康 赵国琦 武艳平 马月辉
为研究槲皮素对脂多糖(LPS)刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎的影响,先将山羊瘤胃上皮细胞在添加0、5、10、20、40、60、80、120、160和320μg·mL~(-1)槲皮素的基础培养基中培养6 h后,通过检测细胞活性,确定80μg·mL~(-1)为槲皮素后续试验浓度。然后分成4组,山羊瘤胃上皮细胞在基础培养基(对照组,Con)和基础培养基[分别加入1μg·mL~(-1)的LPS (L)、80μg·mL~(-1)槲皮素(Q)以及1μg·mL~(-1) LPS和80μg·mL~(-1)槲皮素(L+Q)]中培养6 h后,测定相关指标。结果显示:1)与Con组相比,L组瘤胃上皮细胞的过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低(P <0.05)。综上所述,槲皮素能够提高山羊瘤胃上皮细胞的抗氧化和抗炎症性能,促进细胞增殖。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
金鑫 张曼 王云鹤 魏方 温婧怡 杨银凤
本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
马燕芬 陈琦 杜瑞平 高民
【目的】研究热应激对奶山羊瘤胃上皮细胞屏障通透性的影响,为动物在炎热环境中能够维持正常生理机能以及探索促进动物抗热应激的方法提供理论基础和试验依据。【方法】选用泌乳中后期奶山羊,采用逐渐加热的方式建立奶山羊热应激模型,研究热应激对奶山羊血浆中D-乳酸、DAO、内毒素及炎性细胞因子等异常代谢产物的浓度,瘤胃上皮细胞间紧密连接的变化及紧密连接蛋白Occludin表达的影响。【结果】①热应激显著提高了血浆中D-乳酸和DAO浓度;②热应激显著提高了血浆中内毒素及炎性细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-1β、干扰素-γ的浓度;③热应激破坏了瘤胃上皮间紧密连接的结构,并显著降低了紧密连接蛋白O...
关键词：
热应激 奶山羊 瘤胃上皮细胞 屏障通透性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
马燕芬 杜瑞平 高民
【目的】研究热应激对奶山羊生产性能及瘤胃上皮细胞形态结构的影响,为动物在炎热环境中能够维持正常生理机能以及探索促进动物抗热应激的方法提供理论基础和试验依据。【方法】本项目以泌乳中后期奶山羊为动物模型,采用逐渐加热的方式使奶山羊产生热应激,用温湿指数计算当连续1周早、中、晚THI>72时,动物模型建立;采用动物营养学方法,研究热应激对瘤胃内发酵指标、营养物质消化率、生产性能、瘤胃上皮细胞形态结构和超微结构的影响。【结果】①试验期间试验羊THI主要在72和87之间,处于轻度和高度热应激;②热应激极显著地提高了奶山羊直肠温度和呼吸频率(P<0.01),显著地降低了DM、CP、OM、NDF和ADF消化...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
沈赞明 陈杰 陈伟华
采用3 H -TdR掺入法 ,分 3个系列分别研究了不同剂量五肽胃泌素 ( pentagastrin)对体外原代培养的牛瘤胃上皮细胞DNA合成的影响 ,五肽胃泌素受体拮抗剂丙谷胺对五肽胃泌素营养作用的影响 ,以及五肽胃泌素对新生奶公牛瘤胃上皮细胞DNA合成的影响。结果如下 :1)用终浓度 10 -11,10 -10 和 10 -9mol·L-1的五肽胃泌素分别处理成年奶牛瘤胃上皮细胞 ,使3 H -TdR掺入量增加 30 4 2 % ,2 4 2 6 %和 4 7 16 % (P
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
姜茂成 詹康 严康 赵倩明 赵国琦
在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘林丽 王跃进
应用基因重组技术,将从华东葡萄白河-35-1中分离出的长1179 bp芪合酶(stilbene synthase,STS)基因的cDNA片段克隆入大肠杆菌-酵母菌穿梭型诱导表达载体pYES6/CT上,构建重组酵母真核表达质粒pYES6/CT-STS,转化酿酒酵母菌株INVSc1,用Blasticidin(bsd)筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行5个时间段菌体全蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果发现,诱导4 h后开始有目标带(48 ku)出现,诱导16 h开始大量且稳定表达。证明目的基因片段可以在酿酒酵母中表达,为后续基因功能的验证奠定了基础。
关键词：
芪合酶 酵母表达载体 载体构建 诱导表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵秀 朱小龙 何亚文 梁永恒
[目的]探讨酿酒酵母中磷脂合成相关基因突变对细胞自噬和液泡形态的影响。[方法]通过尼罗红染色观察酵母中磷脂合成相关基因突变后脂滴的形态;用绿色荧光蛋白(GFP)标记细胞自噬蛋白Atg8后,采用荧光显微镜和免疫印迹试验检测突变体细胞自噬的发生情况,并使用荧光染料FM4-64检测液泡形态;此外,检测相关突变体对吩嗪-1-羧酸(申嗪霉素)的敏感性。[结果]在营养有限条件下,酿酒酵母中磷脂合成相关基因突变体中脂滴的大小或数量受到不同程度的影响,但细胞自噬在常规检测条件下正常;其中磷脂酸胞苷转移酶编码基因CDS1突变导致液泡形态异常(碎片化),而其他磷脂合成相关基因突变不影响液泡形态;回补CDS1后,c...
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