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[期刊] 西南农业学报
[作者]
张雪寒 张碧成 栾晓婷 汪伟 周俊明 何孔旺
肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7是重要的食源性病原菌,导致严重的人兽共患病。本文旨在建立以Z0372基因为靶基因的PCR检测技术,特异性检测EHEC O157:H7。以Z0372基因为靶序列,设计引物,建立Z0372-PCR,分析敏感性、特异性,并检测模拟阳性污染样品。结果表明,Z0372-PCR对纯培养物检测限103~104CFU/m L,模拟阳性污水样和肉样,增菌后检测限10~102CFU/m L(g)。非大肠杆菌O157和其他肠道病原全部为阴性扩增,只有肠出血性大肠杆菌O157:H7扩增出清晰而特异的条带。模拟阳性样品检测,条...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张雪寒 何孔旺 赵攀登 栾晓婷 叶青 温立斌 倪艳秀 周俊明 李彬 王小敏 郭容利 俞正玉 茅爱华 吕立新
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子。选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,借助于sm10宿主菌获得O157:H7杂交菌株,通过同源重组,依次获得O157:H7(△hly△stx△toxB)基因缺失株,△hly△stx△toxB接种HEp-2细胞和感染链霉素处理的Balb/c小鼠,明确缺失株粘附定植的能力。经PCR鉴定,hly、stx和toxB基因分别被...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张雪寒 何孔旺 茅爱华 周俊明 俞正玉 温立斌 倪艳秀 郭容利 吕立新
【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后B...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
杨文仪 肖家伟 雷连成 张付贤
为查明南京市某赛鸽公棚赛鸽出现腹泻、死亡的致病病原，本研究对采集的病料进行病原分离鉴定，分析致病菌的血清型、生物被膜表型、毒力基因、耐药菌谱，并对分离菌株进行了人工感染试验。研究表明：1)从患病鸽组织、拭子和粪便中分离出的细菌初步诊断为大肠杆菌O157;分离菌株在NA平板上长出白色、光滑的圆形菌落，在CT-SMAC平板上长出紫红色菌落。2)分离菌株的16S rRNA基因序列与大肠杆菌的相似性达98%～99%,命名为E.c.86246。3)血清学试验表明分离菌株为大肠杆菌O157:非H7菌株，动力试验进一步证实其为动力株。4)分离菌株携带tccp1014、eaeA和hly毒力基因，可导致雏鸡胃肠道出现不同程度的功能损伤，甚至导致死亡；其半数致死量为2.0×10~5 CFU/mL,具有较强的致病性。5)分离菌株携带tetA、tetM、sul2、aadA1和bla_(TEM) 5种耐药基因，具有较弱的生物被膜形成能力，对四环素、氨基糖苷类等抗菌药物严重耐药，对阿莫西林、氧氟沙星和诺氟沙星敏感。综上，本研究分离的鸽源大肠杆菌O157:非H7菌株，具有动力性，有较强的致病性和一定的耐药性，为大肠杆菌O157的流行病学调查、致病机理分析和抗菌药物的精准施治提供理论依据和数据参考。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
赵燕娟 王刚 索朗斯珠
为调查西藏地区牦牛源肠出血性大肠杆菌的流行情况,利用PCR检测和生物进化分析方法,对西藏林芝、拉萨不同地、市149株牦牛源大肠杆菌的肠出血性大肠杆菌相关毒力基因进行了研究。结果表明:牦牛源肠出血性大肠杆菌6对毒力基因中,只检出ehxA基因,检出率为9.40%;对检测到的14株牦牛源肠出血性大肠杆菌进行克隆测序,经系统发育分析发现牦牛源肠出血性大肠杆菌菌株内同源性达到99.9%左右,与GenBank中所录其他菌株的同源性达到99%。因此,西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌基因确实存在,其毒力基因主要为ehxA基因;西藏林芝、阿里、日喀则、昌都均有分布,拉萨、山南和那曲地区未检出,应引起重视。西藏地区要根据各地实际情况需要加强监测肠出血性大肠杆菌引起的腹泻,建立流行毒株预警机制并合理用药。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王娟芳 戴建君 姜敏 任建鸾 李德志 张鹏 孙建和 汤芳
[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O_1、O_2和O_(78)血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,进行特异性和敏感性检测,并对临床模拟样品进行检测。[结果]在三重PCR的25μL反应体系中,dNTP 1.5μL,MgCl_22.5μL,Taq DNA酶0.6μL,O_1、O_2、O_(78)最佳引物加入量分别为0.6、0.2、0.6μL;最佳退火温度为55.9℃。三重PCR的特异性好,3种血清型之间无交叉反应;对146株不同血清型的大肠杆菌进行检测,准确率为99.32%(145/146),用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽胞杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。三重PCR敏感性高,以单一血清型DNA为模板时,O_1和O_2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng·μL~(-1),O_(78)血清型的DNA最低检测限为0.02 ng·μL~(-1);以O_1、O_2和O_(78)混合DNA为模板时,最低检测限为0.05 ng·μL~(-1)。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%(17/18)。[结论]建立了一种能同时检测O_1、O_2和O_(78)3种血清型禽致病性大肠杆菌的三重PCR方法,方法特异性好,敏感性高,适用于临床上禽大肠杆菌病的快速检测。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
庄娜 陈雪影 岳磊 廖晓萍 刘雅红
【目的】检测分离自广东省散养型养殖场的动物源大肠杆菌中oqxAB基因及其它质粒介导喹诺酮类耐药基因(PMQR)的流行情况。【方法】采用PCR方法检测oqxA、oqxB、qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因;琼脂平板稀释法对PMQR阳性菌株进行18种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。【结果】qnrB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr、oqxA、oqxB的检出率依次为10.49%、18.88%、31.47%、44.8%和48.9%,但未检测到qnrA、qnrC、qnrD和qepA。oqxA与oqxB的检出率较高,且oqxA与oqxB常常同时存在。多数菌株同时携带两个或两个以上的PMQR基...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吕殿红 蒋红霞 曾振灵 陈杖榴
【目的】对大肠杆菌AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因进行原核表达,获得的表达产物AcrA、AcrB蛋白分别免疫兔,制备相应的抗体,建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【方法】扩增AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因片段,扩增片段分别与原核表达载体pET-41a(+)连接构建重组质粒,于BL21(DE3)中进行诱导表达。表达产物AcrA、AcrB纯化后分别免疫新西兰大白兔,获得抗AcrA、AcrB抗血清,并用Western blot方法对表达产物进行鉴定分析。纯化的AcrA、AcrB蛋白分别按不同的浓度包被酶标板,与不同稀释倍数的抗血清反应,通过ELISA检测确定最佳抗...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
朱恒乾 廖晓萍 陈朝喜 王秀梅 孙坚 孙迎 李亮 张美君 刘雅红
【目的】对广州分离得到的宠物源(主要是宠物猫、狗)大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药PMQR基因qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因的流行性检测。【方法】采用琼脂平板稀释法对164株临床分离的宠物源大肠杆菌进行15种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。通过PCR检测qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因。建立大肠杆菌基因指纹图谱并对指纹图谱进行分析。【结果】164株宠物源大肠杆菌对12种兽医临床常用抗生素耐药率较高,且表现为多重耐药(5-14耐)。在164株宠物源大肠杆菌中检测到3个菌株同时携带qnrA、qnrB和qnrS基因,其中2株也携带aac(6′)-Ib-cr基因。阳性菌株...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张雪寒 张强 张碧成 汪伟 倪艳秀 温立斌 李彬 周俊明 何孔旺 周萍
本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ＥＬＩＳＡ技术，检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（ＳｈＩｇＡ ｔｏｘＩｇＥｎＩｃ ＥＳｃｈＥｒＩｃｈＩＡ ｃｏＬＩ，ＳｔＥｃ）的抗体水平。根据紧密素２７个亚型的ｎ端保守序列，体外表达３９０～５４３ ＡＡ片段制备包被抗原，通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验，建立检测ＳｔＥｃ的抗体的间接ＥＩＩＳＡ方法。经优化筛选的间接ＥＬＩＳＡ最佳反应条件：抗原包被浓度３ ｎｇ／孔，待检血清稀释比例１∶２００，ｈｒＰ－兔抗羊Ｉｇ ｇ、ｈｒＰ－兔抗牛Ｉｇ ｇ的工作浓度均为１∶１５０００，５％脱脂奶封闭Ｌ ｈ，底物作用时间１０ｍＩｎ，用于牛、羊疫苗抗体检测或者ＳｔＥｃ大肠杆菌．．．
关键词：
致病性大肠杆菌 紧密素 间接ELISA
[期刊] 中国农业科学
[作者]
南海辰 底丽娜 夏利宁
【目的】了解新疆不同动物源喹诺酮类耐药大肠杆菌携带质粒介导的喹诺酮耐药因子(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)的流行现状,及其与主要的β-内酰胺酶基因和16S rRNA甲基化酶基因的共存情况。【方法】通过PCR方法对猪源(79株)、牛源(8株)和羊源(96株)喹诺酮类(环丙沙星,诺氟沙星和恩诺沙星)耐药大肠杆菌进行PMQR(qnrA,qnrB,qnrC,qnrD,qnrS,qepA,oqxA,oqxB,aac(6’)-Ib-cr)、β-内酰胺酶基因(blaTEM,blaCTX-M,blaSHV,blaKPC,blaCMY-2,blaLAP-1...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
舒刚 侯蓉 林居纯 钟钦卿 刘颂蕊 邓向东
为探讨畜禽源大肠杆菌临床菌株产β－内酰胺酶及其基因特性，采用常规检测法检测菌株产β－内酰胺酶情况，ＰＣＲ法检测ＥＳＢＬＳ、ＡｍＰＣ基因型，质粒结合转移试验研究耐药基因分子传播机制，并使用微量肉汤稀释法检测供体菌及接合子的药物敏感性。结果显示：４６７株食品动物源大肠杆菌未检出产碳青霉烯酶和金属β－内酰胺酶，产ＥＳＢＬＳ和ＡｍＰＣ分别达３６．８３％和１３．７０％；１７６株产β－内酰胺酶菌株检出ＢＬＡＴＥｍ、ＢＬＡＣＴＸ－ｍ、ＢＬＡＯＸＡ、ＢＬＡＣＩＴ和ＢＬＡＤＨＡ分别为８４．０９％、６０．８０％、１４．７７％、３５．８０％和１．７０％；本次质粒转移率为５０％，多数转化子获得了供体菌的耐药性及耐药基．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
元振杰 王燕 夏晨阳 陈晓英 刘建枝 马勋
为了解HPI和LEE毒力岛在新疆致犊牛腹泻大肠杆菌中的流行情况,自2010年4月至8月,对新疆塔城市某集约化奶牛场10日龄内5头腹泻病死犊牛及7头严重腹泻犊牛进行病原分离鉴定,12头犊牛病料样品均分离到大肠杆菌。分离菌株进行小鼠腹腔注射均能造成小鼠发病,LD50从1.191×108~1.888×107。采用多重PCR检测LEE毒力岛的ler和eaeA基因和HPI毒力岛的irp2和fyuA基因。结果在分离的12株牛源大肠杆菌中,11株扩增出irp2+fyuA基因片段,1株扩增出fyuA+eaeA基因片段,而ler基因片段扩增均为阴性。结论:引起犊牛腹泻的致病性大肠杆菌中携带HPI毒力岛的情况非常...
关键词：
犊牛腹泻 大肠杆菌 毒力 毒力岛
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐继英 杨志强 陈化琦 刘俊林 邢娟 李建喜 李宏胜
【目的】研究奶牛乳腺炎源大肠杆菌中耶尔森菌HPI携带情况及其与O血清型的关系,并对部分菌株的相关基因序列进行分析。【方法】从中国北京、内蒙古、甘肃、四川、重庆、云南、贵州等7个省市部分地区1 260份临床型和隐性奶牛乳腺炎奶样中分离得到190株大肠杆菌,对分离菌株进行耶尔森菌强毒力岛核心区irp2基因、fyuA基因及HPI毒力岛在大肠杆菌染色体中插入位置的鉴定,分析HPI毒力岛的携带情况及其与分离菌株O血清型之间的关系。【结果】190株大肠杆菌分离株中,irp2基因阳性率为26.31%(50/190),fyuA基因阳性率为18.94%(36/190)。50株HPI+分离株中检出asn_tRNA...
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