为探究长链脂酰辅酶A合成酶(Long-chain acyl-CoA synthetases,ACSLs)在绵羊脂肪组织的表达规律,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和双荧光素酶活性检测系统等方法进行研究。结果表明:1)绵羊ACSL1基因因选择性多聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,APA)存在2个不同长度的3′UTR;2)较短的3′UTR在绵羊前体脂肪细胞诱导分化前期更活跃,并且短3′UTR更有助于ACSL1蛋白表达;3)miR-202、miR-449a、miR-124a、miR-218均可与ACSL1 3′UTR结合,降低荧光素酶活性,其中miR-218通过与ACSL1 3′UTR的1 264～1 271bp处结合可显著降低ACSL1表达。综上,ACSL1基因因选择性多聚腺苷酸化存在不同长度的3′UTR,且短3′UTR有助于基因表达;miR-218可显著下调ACSL1基因表达。本研究为绵羊ACSL1基因的进一步研究提供理论依据。

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因(crp),通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体...

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3'非编码区(UTR)为393 bp,5'非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的...

为研究可溶性腺苷酸环化酶(sAC)基因的组织特异性表达及其在不同周龄小鼠睾丸中的表达情况,探讨其在精子发生及获能中的作用,运用RT-PCR法分析小鼠sAC基因的组织表达情况及其发育的时序性变化。结果显示,sAC基因优先表达于睾丸和附睾,表达量随发育周龄的增长而呈增加趋势:于2周龄开始检测到它的表达,随后表达量显著增加至6周龄,再逐渐增长至一个平台期,呈现出发育阶段性,说明sAC在精子形成及获能过程中具有特殊作用。

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)环腺苷酸磷酸二酯酶(c AMP phosphodiesterase,PDE)基因,并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达,为深入探索c AMP信号途径调控病菌致病性的作用机制打下基础。【方法】根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、绿僵菌(Metarhi

以2年生红椿家系盆栽幼苗为实验材料,开展了外源多胺对红椿干旱胁迫下TcSAMDC基因表达的修复效应研究。实验设置了轻度、中度和重度3种干旱胁迫梯度,干旱结束后,喷施了1 mmol/L的外源腐胺(Put)、亚精胺(Spd)及精胺(Spm)溶液作为修复处理,旨在探索湖南本土珍贵树种红椿Toona ciliata在遭受季节性干旱胁迫后的生理变化以及有效修复措施。结果表明:1)成功克隆了红椿S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(Tc SAMDC)基因片段,测序得到一条532碱基对的DNA。2)外源Put、Spd和Spm溶液对不同程度干旱胁迫下红椿Tc SAMDC基因表达的修复效果都非常显著(α=0.01)。3)3种外源多胺在不同程度干旱胁迫下对红椿叶片的Tc SAMDC基因表达表现出不同的修复调节作用,其中以外源Spd效果最佳。因此,人为施加外源多胺能在很大程度上影响红椿TcSAMDC基因的表达,进而影响植株的干旱修复能力。采用人工喷施外源多胺诱导Tc SAMDC基因表达,于对抗干旱胁迫具有极强的实际操作意义。

为深入研究MdIPTs基因在苹果细胞分裂素合成途径中的作用和利用转基因技术改良苹果树型,分析苹果(Malus×Domestica Borkh.)A-IPTs基因的时空表达,本研究以‘富士’苹果(M.Domestica Borkh.cv.Fuji)及其组培苗为试材,利用半定量RT-PCR方法分析7个A-IPTs基因在梢尖、幼叶、茎段节间、皮部组织、叶芽、花芽、花蕾、花、幼果和根部的表达水平。结果表明:MdIPT3a总体表达水平最高、MdIPT1b次之,在所检测的器官组织中均有表达;MdIPT5a在花蕾和花中表达量高,MdIPT5b在梢尖和幼叶中表达量高;MdIPT1a在根、皮部组织和叶芽中检测到...

文章旨在研究沙葱和油籽对羊肉中肌苷酸和腺苷酸含量的影响,为沙葱和油籽用于羊肉品质的改善提供科学依据。试验选用28只蒙古羯羊,采用完全区组试验设计,试验组分别为精料中添加4%沙葱、3种油籽(8%胡麻+2%向日葵籽+2%线麻籽)及沙葱+油籽(4%沙葱+8%胡麻+2%向日葵籽+2%线麻籽),对照组饲喂基础日粮。结果表明,添加沙葱+油籽组可显著提高背最长肌IMP的含量(P0.05);添加4%沙葱组和沙葱+油籽组显著提高臀中肌IMP的含量(P0.05)。添加3种油籽组...

【目的】已有研究获得鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白(oligoadenylate synthase-like protein,OASL)基因全长,并且证明其可以抑制鸭坦布苏病毒复制。因此在通过原核表达和多克隆抗体制备技术获得带有GST标签的鸭寡腺苷酸合成酶样融合蛋白和该融合蛋白的特异性抗体,为进一步明确鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白抑制病毒复制分子机制提供物质基础。【方法】根据前期研究已经获得的鸭OASL基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列设计全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用动物组织总RNA提取试剂盒提取健康樱桃谷鸭幼鸭脾脏总RNA;通过RT-PCR,利用随机引物和M-MLV反转录酶扩增获得鸭脾脏cDNA,以cDNA为模板,利用设计合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物进行PCR扩增,扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测后将片段大小与目的条带大小相同的PCR产物切胶纯化,纯化后的产物克隆到pEASY-T1载体,挑取单克隆菌落送基因公司测序,测序验证正确的PCR纯化产物通过限制性内切酶Bam H I和Xho I酶切连接至带GST标签的原核表达载体pGEX-4t-1。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(PLYSS)~(TM),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导表达4 h后检测该融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表达。利用GST柱亲和纯化上清中的可溶性融合蛋白,经20 mmol·L~(-1) Tris-HCL和0.10 mol·L~(-1)NaCL溶液透析后获取纯化的融合蛋白,采用SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白。采用皮下多点注射方法免疫新西兰白兔,经3次免疫后制备多克隆抗血清,采用SDS-PAGE和间接免疫荧光检测抗体的纯度和效价。【结果】克隆测序结果表明,设计合成的鸭OASL基因全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R能够从樱桃谷鸭脾脏中获得鸭OASL基因ORF序列,并且序列组成与前期研究结果一致。被扩增的序列经酶切后,鸭OASL基因能够与pGEX-4t-1载体成功连接,IPTG诱导后可以在大肠杆菌BL21(PLYSS)TM中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,融合蛋白大小约为84 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。经GST亲和层析纯化上清中的可溶性鸭OASL融合蛋白,得到0.5 mmol·L~(-1)纯度抗原蛋白。经3轮免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,纯化后ELISA结果显示鸭OASL蛋白抗体具有较好的灵敏度,最高效价为1:512 000,SDS-PAGE结果显示抗体大小为55 kD,与ORF理论值相同,且抗体纯度为90%以上。【结论】设计合成的引物能够成功地获得鸭脾脏OASL基因ORF序列,该ORF能够在原核细胞中成功表达,表达的融合蛋白通过免疫新西兰兔能够获得高纯度和高效价的鸭OASL多克隆抗体,研究成果为后续深入研究鸭OASL蛋白抑制病毒复制分子机制奠定坚实的物质基础。

【目的】全面了解绵羊卵巢组织mi RNAs表达情况,分析产单羔和产双羔绵羊卵巢mi RNAs表达差异,从而为探讨mi RNAs在繁殖力调控中的作用提供依据。【方法】应用多物种mi RNA芯片对绵羊卵巢组织mi RNA进行表达分析。首先选择经产单羔羊和双羔羊,发情后采集双侧卵巢提取总RNA,分离小片段RNA与mi RNA芯片杂交,然后进行数据分析获得绵羊卵巢组织mi RNAs表达谱;利用生物信息学软件,以q-value≤5%,且Fold Change≥2或≤0.5的标准筛选单羔羊和双羔羊卵巢差异表达mi RNAs,并利用q-PCR技术验证芯片结果;分别采用micro T和mi RDB两种方法预测...

【目的】全面了解绵羊卵巢组织ｍｉ ＲＮＡｓ表达情况，分析产单羔和产双羔绵羊卵巢ｍｉ ＲＮＡｓ表达差异，从而为探讨ｍｉ ＲＮＡｓ在繁殖力调控中的作用提供依据。【方法】应用多物种ｍｉ ＲＮＡ芯片对绵羊卵巢组织ｍｉ ＲＮＡ进行表达分析。首先选择经产单羔羊和双羔羊，发情后采集双侧卵巢提取总ＲＮＡ，分离小片段ＲＮＡ与ｍｉ ＲＮＡ芯片杂交，然后进行数据分析获得绵羊卵巢组织ｍｉ ＲＮＡｓ表达谱；利用生物信息学软件，以ｑ－ｖＡｌｕｅ≤５％，且Ｆｏｌｄ ＣｈＡＮｇｅ≥２或≤０．５的标准筛选单羔羊和双羔羊卵巢差异表达ｍｉ ＲＮＡｓ，并利用ｑ－ＰＣＲ技术验证芯片结果；分别采用ｍｉＣＲｏ Ｔ和ｍｉ ＲｄＢ两种方法预测．．．

【目的】克隆鸭腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase,ADSL)基因的完整编码区(codingsequences,CDS),对其进行核酸和蛋白序列分析,研究该基因在各品种肌肉组织mRNA表达水平;对该基因mRNA表达水平与肌肉组织肌苷酸(inosine monophosphate acid,IMP)含量进行相关性分析。为揭示中国优良地方鸭种的风味基因结构、研究其生物学功能以及与重要风味物质的关系奠定理论基础。【方法】通过PCR扩增和克隆测序获得鸭ADSL基因部分cDNA序列,运用生物信息学方法分析鸭ADSL基因编码区序列、蛋白结构和进化关系,利用real-time-PC...

为揭示藏绵羊高原低氧的适应机制,选择与高原动物低氧适应相关的EGLN1基因为研究对象,分析绵羊群体中该基因的遗传变异特征,为进一步寻求分子育种提供依据。采用荧光定量PCR及PCR-SSCP技术检测了藏绵羊和湖羊不同组织EGLN1基因表达量及其intron6-intron7区的核苷酸变异特征。结果显示:EGLN1基因在2个绵羊群体各组织间均有表达且存在组织差异性。其中,湖羊各组织的表达量均高于藏绵羊,在心脏、肝脏和肾脏组织差异最大。在2个绵羊群体EGLN1基因intron6-intron7区检测到了6个SNPs、1个碱基的插入和1个碱基的缺失位点,2个群体间等位基因和基因型频率存在统计学差异(P

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC;EC 4.1.1.50)是多胺合成过程中的限速酶。以日本百脉根EST序列为基础,通过设计特异引物进行RT-PCR扩增,获得了S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶编码cDNA,命名为LcSAMDC1。LcSAMDC1基因组序列全长2 626 bp,存在3个内含子;cDNA序列全长1 799 bp,存在3个植物SAMDC基因特征性ORF,其中tORF编码2个氨基酸残基,sORF编码55个氨基酸残基,mORF编码354个氨基酸残基;mORF编码产物推断的分子量为38.6 kDa,具有2个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域);半定量RT-PCR分析显示,LcSAM...

组合运用分子生物学及生物信息学方法,首次从毛白杨成熟木质部中分离出编码S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因PtSAHHA的cDNA克隆。序列分析表明,毛白杨PtSAHHA cDNA片段全长为1 935 bp,其内部含有大小为1 458 bp的完整开放阅读框架,可编码含有485个氨基酸残基的蛋白质。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSAHHA在木质部中表达丰度最高,在形成层和老叶中表达丰度中等,在嫩叶中表达丰度最低。在此基础上,组合利用MAGE5.0和DnaSP5软件对毛白杨自然群体中45株基因型个体的PtSAHHA序列进行对比和分析,共检测到166个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频...