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[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈信忠 苏亚玲 龚艳清 黄丽莎 俞秀霞 苏永全
神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘荭 高隆英 史秀杰 江育林
A reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) was used for detection of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) from the gills and subcutaneous tissue of Penaeus vannamei (10-15cm in body size) without clinical signs. With primers 77012R and 77353F, a fragment o...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
郑艳萍 Chander Subhash 杨小红 周俊青 李建生 严建兵
SNP是具有广泛利用潜力的第3代分子标记,本文旨在开发一种利用PCR技术快速检测SNP的方法。设计思路是:根据已知SNP位点设计2条特异正向引物,其最后一个碱基分别与已知SNP的2个碱基相同,同时在1条引物的5′端添加1段20 bp左右的其他物种的特异序列(如细菌DNA序列),然后选择1条合适的反向引物;最后同时加入3条引物,通过梯度PCR选择合适的退火温度进行PCR反应。利用这一方法成功将玉米的ZDS基因定位在玉米第7染色体短臂7.02 Bin。这种检测SNP的方法设计简单,费用低廉,尤其适合SNP标记的分子标记连锁图构建或者基因定位。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李艳 仇华吉 王秀荣 张守发 朱庆虎 李娜 李国新 童光志
【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
罗卫 李惠芳 刘荭 陈焕春 范万红 刘宗晓 田飞焱 王侃 吕建强
根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神...
[期刊] 水产学报
[作者]
李军 王铁辉 周立冉 易咏兰 刘汉勤 陆仁后 陈宏溪
人工感染GCHV－861后，对处于潜伏期、发病期和恢复期等不同时期的草鱼内脏组织匀浆上清液进行逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）扩增，除恢复期的1条草鱼外，其余样品均得到特异扩增带，而对照组都没有，预示着RT－RCR技术对于草鱼出血病的早期诊断、防治及抗病有种具有重要意义。另外，对于显症出血病草鱼的肝、肾、脾、鳃、肌肉和肠道等组织器官进行检测，结果都为阳性，首次证实了GCHV存在于肝脏中，并对此作了进一步的讨论。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
战文斌 邢婧 王远红 铃木信一 福田颖穗
对虾WSSV病是亚洲对虾养殖业中的一个棘手问题。本研究采用Kimura引物 ,用PCR技术对不同生长期的中国对虾 (Penaeuschinensis)进行了WSSV的检测 ,同时也检测了对虾发病时养殖池中多见的野生厚蟹 (Helicesp .)和矛尾刺虎鱼 (Acanthogobiushasta)。检测结果表明 :分别在检测的 5尾亲虾中的 1尾 ,6尾仔虾中的 1尾 ,5尾稚虾中的 3尾及所检测的 5尾病虾和 2只厚蟹中获得到 982bp的PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阳性。在检测的 2尾矛尾刺虎鱼中均未获得PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阴性。在亲虾、虾苗以及虾池内的野生厚蟹...
关键词：
对虾 白斑症病毒 聚合酶链反应
[期刊] 水产学报
[作者]
潘莹 杨家辉 彭发永 黄友华 秦启伟 黄晓红
为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的方法，本研究针对SGIV特异基因ORF014L序列设计特异性引物及探针，建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)(RPA-LFD)的SGIV检测技术。RPA反应使用10μmol/L的引物浓度，在40.1°C恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测，最低检测限为10~2个/μL标准质粒。RPA-LFD反应在42°C恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现，最低检测限为10~1个/μL标准质粒，且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应，临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV，两者的检测限均比常规PCR灵敏。RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点，在临床应用具有较好的应用前景。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李晋 史成银 王胜强 粟子丹
本研究依据赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)RNA2的序列,在其3′端设计反转录引物,在5′端设计PCR扩增引物,构建了一种可以评价RNA链相对完整性的RT-PCR方法,命名为LR RT-PCR(Left reverse transcript Right amplify RT-PCR),并对该方法的引物浓度、Mg2+浓度、d NTPs浓度、退火温度4个重要参数进行了优化。结果显示,优化后的LR RT-PCR反应体系为:引物浓度0.2μmol/L、Mg2+浓度4 mmol/L、d NTPs浓度0.5 nmol...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈晓艳 何建国
将含有斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus,OGNNV)的主衣壳蛋白(main capsid protein,MCP)基因的重组质粒pET32a-MCP转入大肠杆菌BL21后,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用柱层析纯化表达的融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗MCP融合蛋白的血清。用ELISA方法检测抗血清的效价,用Western-blot检测抗血清的特异性。结果显示,获得的抗血清稀释1∶22 000倍时仍呈阳性,并能有效中和OGNNV,实验组的相对...
关键词：
斜带石斑鱼神经坏死病毒 主衣壳蛋白 抗体
[期刊] 水产学报
[作者]
黄桂菊 陈健光 喻达辉 曾令兵 龙华
利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
林楠 吴斌 李苗苗 王巧煌 林国清 樊海平 林克冰
对福建省漳州市某水产养殖场发生的疑似病毒性神经坏死病的病鱼进行病原分离和鉴定.从出现疑似病毒性神经坏死病症状的石斑鱼苗上取眼部、脑部组织进行研磨,将匀浆液接种到条纹月鳢细胞系(SSN)细胞株SSN-1及其克隆细胞株E-11,两株细胞均出现明显的细胞病变,细胞肿胀变圆,呈空泡化并脱落,E-11细胞较SSN-1细胞更早出现细胞病变,且病变更明显.将病鱼眼部、脑部组织的研磨液、细胞培养上清进行RT-PCR检测,均检测出病毒性神经坏死病病毒(VNNV)的特异性条带,目的片段大小为427 bp,序列比对结果提示该病原为赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV).电镜观察结果显示,细胞培养上清中存在直径约30 nm的病毒颗粒,细胞质内大量病毒颗粒聚集成团,细胞器受损,细胞结构被破坏.将分离得到的VNNV进行温度、酸碱度敏感性试验,结果显示:50℃下处理30 min后该病毒滴度明显下降,60℃处理30 min后病毒失活;在pH为3、11的条件下病毒滴度均明显下降.
关键词：
石斑鱼 病毒性神经坏死病 分离 鉴定
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张巧萍 丁元明 王云月 李 周剑 段禄华 白永华 孙兵绍
根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot tospovirus,INSV)S RNA上的核衣壳蛋白(N)基因序列(登录号为AB109100)保守区设计了3对特异性引物。应用常规RT-PCR和巢式PCR方法从表现同心圆症状的文心兰植株上检测得到了预期DNA片段,且巢式PCR检测灵敏度比常规PCR高。序列分析结果表明,该病毒的N基因序列和已经发表的凤仙花坏死斑病毒(登录号为AB109100、AB207803、DQ425096)核苷酸序列同源性为99%,确定表现同心圆症状的文心兰上携带了凤仙花坏死斑病毒。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
汪俊 薛长湖 李兆杰 蔡跃飘 何闪闪 杨文鸽
利用pH9.5的甘氨酸缓冲液性处理太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)匀浆液,PEG沉淀病毒粒子的方法对未知的是否污染有诺瓦克样病毒(Norwalk-like Virus,NLVs)的牡蛎样品进行处理,并提取病毒RNA,进行RT-PCR,凝胶电泳检测扩增结果。初步建立了牡蛎中NVLs的检测方法。纯化所得的特异PCR产物,克隆到T-载体中,筛选转化子,提取质粒,并进行PCR电泳鉴定。重组质粒序列测定结果在NCBI上进行BLASTn显示所得产物与已发表的诺瓦克样病毒的相应序列具有极高的同源性(>95％);根据Genebee在线分析系统AliBee-Multiple Alignment进...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄剑南 林蠡 翁少萍 何建国
Viral nervous necrosis (VNN) is a worldwide disease among teleost fish. In the mainland of China, VNN was first identified in 2 species of hatchery-reared groupers, Epinephelus akaara and E. coioides. In the present study, samples were collected from larvae of E. akaara with signs of VNN in Dayawan ...
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