人工注射溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis),通过实时荧光定量RT-PCR方法检测了近江牡蛎6种不同组织器官(外套膜、鳃、消化腺、闭壳肌、心脏和血细胞)中HSC70基因表达量的变化;同时采用平板活菌计数法测定了近江牡蛎不同组织器官中溶藻弧菌菌量的变化。结果显示,人工注射感染溶藻弧菌后,近江牡蛎6种组织器官中HSC70基因表达量均显著性升高(P<0.05),且随时间变化均呈现出先升高后恢复至对照水平的趋势;其中鳃组织中HSC70基因分别在第6小时和第72小时出现2次显著性高表达,且在第72小时的表达量高于第6小时(...

为探讨日本蟳感染溶藻弧菌的致病机理，采用溶藻弧菌人工感染健康日本蟳，分析了感染前后日本蟳肝胰腺ＰＯ、ＳＯＤ和ＬＳＺ活性变化及注射免疫多糖后的免疫保护率，并研究了细胞超微结构的病理组织学。结果表明：日本蟳感染溶藻弧菌后，肝胰腺中ＰＯ、ＳＯＤ和ＬＳＺ的活性均受到不同程度的影响，感染６～１２ ｈ，３种酶的活性均有一个上升的过程，但之后随时间的延长呈现下降趋势；免疫感染组因感染弧菌前注射了免疫多糖，日本蟳肝胰腺中ＰＯ、ＳＯＤ和ＬＳＺ酶活性均显著高于感染组的酶活性，感染７ Ｄ后的免疫保护率高达７２．７３％，表明免疫多糖可提高酶的活性，使机体的抗病菌能力增强。超微结构显示：对照组日本蟳肝胰腺细胞结构形态正．．．

为了研究Rse基因缺失对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染花鲈（Lateolabraxmaculatus）能力的影响，评估了花鲈感染后的LD_(50)、定殖能力和免疫响应，结果显示，溶藻弧菌野生株LD_(50)为2.013×10~(5)cfu/mL，RseB缺失溶藻弧菌LD_(50)为5.526×10~(5)cfu/mL，RseB缺失溶藻弧菌毒力下降63.6%；溶藻弧菌主要在花鲈的鳃部、肠道和皮肤定殖，相对野生菌株，RseB缺失溶藻弧菌定殖肠道的空泡化程度更低，鳃组织结构的损坏程度更低；分别对野生株与RseB缺失溶藻弧菌感染的花鲈头肾组织进行转录组测序，发现与免疫相关的差异表达基因一共有236个，其中包括了122个显著上调的免疫基因和114个显著下调的免疫基因，大部分显著富集在Th1和Th2细胞分化、B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路等特异性免疫通路上，部分基因显著富集在与细胞凋亡相关的通路以及与炎症相关的NF-kappa B信号通路中。综上结果表明RseB缺失溶藻弧菌能引起宿主细胞的免疫反应且毒力明显降低。

为了解大黄鱼在抗溶藻弧菌感染时免疫功能的变化规律,将160尾健康大黄鱼分为感染组和对照组,通过腹腔分别注射0.2mL浓度为2×107CFU.mL-1的溶藻弧菌和灭菌生理盐水,在注射0,1,3,7,11,15,19d后从两组各取6尾大黄鱼,尾静脉取血,进行外周血的血相、NBT阳性细胞数、血清抗菌活力、抗体效价等免疫学指标的测定。结果显示:在人工感染的初期,感染组大黄鱼外周血的红细胞、白细胞、淋巴细胞和NBT阳性细胞的数量及血清抗菌活力等指标均较对照组有显著提高;在注射后1d外周血粒细胞的数量显著低于对照组;抗体效价在7d开始增加,15d达到峰值,且用间接ELISA和试管凝集两种方法所得结果具有非...

分别给凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)注射生理盐水、3×106 CFU/mL(低浓度组)和9×106 CFU/mL(高浓度组)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)菌液,采用荧光定量PCR技术,检测不同处理后凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶基因表达量随时间的变化。结果表明,处理42 h内,注射生理盐水组对虾的Toll受体和IMD mRNA表达量无显著变化,溶菌酶mRNA表达量在注射36 h后显著升高。急性感染溶藻弧菌后,凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA的表达量峰值分别出现在感染后24、42和36 h;溶藻弧菌的感染剂量不影...

近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)热休克蛋白70(HSP70)家族成员是重要的抗逆和潜在污染预警分子。本研究将近江牡蛎HSP70基因cDNA连接到原核表达载体pQE30中,构建近江牡蛎HSP70的重组表达质粒pQE30/HSP70。该重组质粒经酶切和测序鉴定后,转入表达宿主大肠杆菌M15进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Westernblot分析表明,确实获得了重组蛋白的表达。分别在25℃、30℃和37℃下,经0.2mmol/LIPTG诱导融合蛋白表达,其中,在25℃下,诱导的融合蛋白表达量最高,表明该温度为恰当诱导温度;在25℃下,分别诱导重组蛋白表达2h、4...

采用表达序列标签(EST)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)从松江鲈(Trachidermus fasciatus)体内克隆出一个热休克同源蛋白70(即TfHsc70)。其全长2 138 bp,理论分子量为71.1 kDa,等电点为5.27,并由一个1 947 bp的开放阅读框(ORF)、一个78 bp的5′端未翻译区(UTR)和一个95 bp的3′端带有终止密码子(TAA)的UTR组成。通过与多种鱼类、两栖类和爬行类等动物的热休克同源蛋白70(HSC70)对比发现,其具有88.89%～97.09%的相似性。实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)显示,TfHsc70 mRNA在松江鲈的血液、心脏、肝脏、胃、肠、脾脏、肾脏、大脑、鳃中均有表达,但在皮肤中几乎未检测出。使用脂多糖(LPS)刺激发现,皮肤、血液和肝脏中TfHsc70的表达量在2 h时明显增加,鳃和脾脏中略微上调,而在大脑中呈现先减少再增加的趋势。基于对TfHsc70的蛋白序列以及TfHsc70 mRNA的表达分析,表明TfHsc70是热休克蛋白HSP70家族成员,它可能参与了松江鲈的先天免疫。

为了研究牡蛎养殖过程中副溶血弧菌与水质因子之间的关系,2009年3月到11月从广东阳西某牡蛎养殖场采集牡蛎样品检测其副溶血弧菌的感染情况,并检测水体温度、盐度、pH和溶解氧。实验结果表明:副溶血弧菌总量的检出率为94.38%。水温和副溶血弧菌总量呈正相关,盐度和副溶血弧菌总量呈负相关,pH和溶解氧与副溶血弧菌总量的相关性不明显。对水温和盐度与副溶血弧菌总量的对数进行回归分析,水温和副溶血弧菌浓度的拟合回归方程为LgVP=0.093T-0.685(R2=0.336);盐度和副溶血弧菌浓度的拟合回归方程为LgVP=1.199+0.116S-0.004S2(R2=0.217);水温和盐度对副溶血弧菌...

以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180 CFU/mL。同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%。结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测。

为了研究热激同源蛋白70(70 kDa heat shock cognate,HSC70)在孔雀鱼(Poecilia reticulata Peters)对环境适应中的作用,采用电子克隆与传统实验克隆相结合的技术,分析了孔雀鱼的一个HSC70基因(命名为PrHSC70)。PrHSC70基因包含一个长1941 bp的完整编码区,含有8个内含子。PrHSC70蛋白具有HSP70蛋白家族的特征序列,且与其他动物HSC70和HSP70都高度相似。在进化树上PrHSC70与所有鱼类HSC70聚为一簇,与它们的氨基酸序列一致性为93.2%～98.9%。

为阐明毒力因子溶血素对鳗弧菌感染花鲈过程中发挥的作用，实验以花鲈为研究对象，通过对花鲈幼鱼分别注射5.0×10~5 CFU鳗弧菌野生株和缺失株△vah1-vah4-rtxA，评估了溶血相关基因缺失对花鲈的感染能力、花鲈各组织的病理变化情况以及免疫响应的影响。结果显示，花鲈感染野生株后的LD_(50)为2.103×10~5 CFU/mL，感染缺失株△vah1-vah4-rtxA后LD_(50)为1.837×10~6 CFU/mL，溶血相关基因缺失使鳗弧菌毒性降到原来的11.44%；鳗弧菌主要定植在花鲈的肠道和鳃中，溶血相关基因缺失降低鳗弧菌在花鲈体内的定植能力，同时降低对鳃和肠道的损伤程度；转录组分析表明vah1、vah4和rtxA缺失后，头肾组织的差异表达基因显著富集到造血细胞谱系、抗原处理和呈递、细胞黏附分子、肠道免疫网络的IgA生产等免疫通路，并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对表达水平进行了验证。研究表明，溶血相关基因缺失降低了鳗弧菌感染花鲈的致病能力。研究结果有助于进一步了解鳗弧菌的致病机制，并为开发花鲈抗弧菌免疫增强剂或减毒疫苗提供依据。

【目的】研究凡纳滨对虾Crustin-like基因(即CL基因)的结构和功能,探明CL基因是否参与副溶血弧菌侵染条件下的免疫应答,为进一步研究凡纳滨对虾的免疫机制和抗病育种奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆凡纳滨对虾CL基因;用DNAstar、Clustalx、MEGA 5.0、PROSITE、TMpred和SignalP软件,分析CL基因序列及其蛋白结构,并预测蛋白功能;利用副溶血弧菌进行攻毒试验和实时定量PCR,检测CL基因在病原侵染条件下的表达情况。【结果】克隆获得了凡纳滨对虾CL基因(登录号:JQ824114)的cDNA,全长为501bp,含有33bp的5′非翻译区(1～33b...

研究以实验室分离自汕头牛田洋青蟹养殖区的副溶血弧菌感染的健康拟穴青蟹,利用cDNA-AFLP技术分析感染前后拟穴青蟹肝脏组织基因的转录表达差异,最终获得了23个差异片段,其中20个片段成功测序。BLAST分析表明,序列与已知功能基因具有同源性的有6个,其中5个经real-time PCR重新验证为上调表达,主要涉及参与能量代谢的精氨酸激酶(arginine kinase)和甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase),以及参与转运过程的精氨酰tR...

为了筛选可用于防治虾苗细菌性玻化症(bacterial vitrified syndrome， BVS)的中药复方，本研究首先通过牛津杯法和二倍稀释法进行体外抑菌实验，从50种中药中筛选出对BVS致病菌溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)具有良好抑菌效果的中药。其后，以不同浓度的溶藻弧菌浸浴感染虾苗，建立BVS病理模型；再通过体内药效学实验从死亡率、组织病理学和超微组织病理学角度比较不同中药复方对于患BVS虾苗的防治效果。体外抑菌实验结果显示，五味子(Schisandrae chinensis fructus)、马鞭草(Verbenae herba) 、乌梅(Mume fructus)等中药对溶藻弧菌的抑菌圈直径可达12 mm以上；诃子(Chebulae fructus)、五味子、牡丹皮(Moutan cortex)等中药对副溶血弧菌的抑菌圈直径可达13 mm以上。五倍子、诃子、五味子、丁香(Caryophylli flos)对溶藻弧菌和副溶血弧菌的最小抑菌浓度(MIC)均≤12.5 mg/mL，最小杀菌浓度(MBC)均≤50 mg/mL。结合香附(Cyperi rhizoma)、栀子(Gardeniae fructus)两味中药组成3种中药复方，处方1、处方2和处方3；以5×10~(4) CFU/mL的溶藻弧菌感染虾苗成功建立BVS病理模型，在此基础上采用药物治疗患病虾苗7 d，各组死亡率由低至高为：空白对照组<处方1组<20%氟苯尼考粉对照组<处方3组<处方2组<阳性对照组。处方1组虾苗死亡率显著低于阳性对照组(P<0.05)；处方2、3组和20%氟苯尼考对照组虾苗死亡率低于阳性对照组，但差异不显著(P>0.05)。由此可见，处方1可显著降低患病虾苗死亡率。组织病理学和超微组织病理学研究显示，相比于其他感染组，处方1组虾苗肝胰腺病变程度明显较轻，肠道结构较为完整；虾苗肝小管上皮细胞的细胞膜、细胞核正常，线粒体、内质网丰富且基本正常。表明，口服处方1可对患病虾苗的肝胰腺和肠道组织起到良好的保护作用，并优于处方2、处方3和20%氟苯尼考粉。综上所述，处方1(诃子30 g、五味子20 g、香附20 g)对溶藻弧菌感染的虾苗保护和治疗效果良好。本研究结果为研制防控虾苗BVS专用中药提供依据，助力对虾养殖绿色高质量发展。

为了评估太平洋牡蛎与近江牡蛎能否产生远缘杂种优势,于2010年5月,以成熟的两种牡蛎亲本为材料开展了2×2远缘杂交研究,由长牡蛎自繁组GG(Crassostrea gigas♀×C.gigas♂)、近江牡蛎自繁组AA(C.ariakensis♀×C.ariakensis♂)、正交组GA(Crassostreagigas♀×C.ariakensis♂)、反交组AG(C.ariakensis♀×C.gigas♂)4个实验组组成。分析了子代早期表型性状和杂种优势,并对杂交子代进行了遗传鉴定。结果表明:GA杂交组与AG组的受精强度具有不对称性。幼虫浮游期间,表型性状的中亲杂种优势几乎为0,GA组生长与...