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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈琳 余海翔 张忠明
以蒺藜苜蓿(A17)的成熟根瘤为材料,联合应用Gibson克隆技术和SMART cDNA技术构建cDNA文库,其转化效率达到7.74×105cfu/3μg pGADT7-Rec-New。随机菌落PCR检测结果表明,插入DNA片段的大小为0.52.0kb,其中插入片段>0.75kb的占45.6%,文库的重组效率达到91.7%,构建的cDNA文库以质粒形式保藏备用。采用此法不仅可以构建用于酵母单杂交或双杂交的文库,同样也适用于其他质粒文库的构建。利用酵母单杂交技术,以在根瘤中高表达基因启动子元件为诱饵,筛选构
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
朱浩 朱辉 杨绮 陈春芬 张忠明
以豆科植物百脉根为材料,构建了AD-cDNA表达文库。其库容量达到每3μg DNA 2×106酵母转化子,空载率为12.5%,平均片段长度为1.5 kb。以百脉根结瘤因子受体激酶基因1(nod factor receptor kinase,NFR1)蛋白激酶结构域的DNA片段(NFR1-PK)为诱饵,利用酵母双杂技术,筛选与NFR1相互作用的基因。结果在含X-gal的四缺选择性培养基上筛选到120个克隆。经质粒抽取、PCR鉴定、回转酵母验证得到80个阳性克隆。对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析,通过NCBI数据库比对分析鉴定含有JAB1、AT-RICH结构域等4个与NFR1-P...
[期刊] 华北农学报
[作者]
康静敏 刘坤 刘严 张怡 李成伟 谭光轩
为了分离克隆与植物互作的大丽轮枝菌致病相关蛋白基因,利用SMART技术构建了大丽轮枝菌酵母双杂交c DNA文库。结果表明,构建的文库滴度为5.2×107cfu/m L,库容为3.9×107cfu;文库c DNA插入片段长度主要分布在0.5~2.0 kb,平均为1 kb;文库重组率为96%。表明文库质量较好,为筛选与植物互作的大丽轮枝菌致病蛋白基因奠定了基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨长庚 刘姗姗 孙冰 陈松林
为了研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)免疫及抗病相关蛋白和大分子物质的功能及相互作用机制,构建了牙鲆酵母双杂交cDNA文库。原始文库滴度为1.6×106 CFU/mL,随机选取单克隆菌落进行PCR扩增,根据PCR扩增结果表明插入片段大部分大于500 bp,平均长度约为1.5 kb,随机调取了115个EST进行了序列测定。扩增后放大文库库容约为1.8×1012 CFU。转化酵母后,文库转化效率为3.6×105CFU/μg,文库库容为5.4×106CFU。牙鲆酵母双杂交文库的构建成功为鲆蝶类免疫机理的研究,尤其是信号分子通路研究提供有效的工具。
关键词：
牙鲆:酵母双杂交 免疫相关基因 信号通路
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨倩 包涛涛 鲜思美 张友 梁倩 顾庆林
为筛选与羊口疮病毒(OrfV)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，构建了羔羊睾丸(LT)细胞酵母双杂交cDNA文库.采用Trizol法提取LT细胞总RNA,运用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,再经同源重组法将pGADT7-Rec载体与cDNA共转化至Y187酵母菌株，利用营养缺陷型选择性培养基(SD/-Leu)筛选阳性克隆，并鉴定文库质量.结果显示：LT细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功，其文库滴度为2.33×10~8 CFU·mL~(-1),文库容量达3.5×10~9 CFU;随机挑选34个单克隆进行PCR检测，插入片段大小为250～2 000 bp,平均大小约为1 000 bp,文库重组率达100%.由此表明，本文库达到高质量文库条件，可作为研究OrfV与宿主细胞间互作机制的生物材料.
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
费日雯 樊富伟 孙天祎 辛如洁 宋文慧 关士鑫 孙晓梅
【目的】芍药具有极佳的观赏价值，但其种子的双重休眠难以解除，严重阻碍芍药的育种进程。本研究利用gateway技术构建芍药种子休眠解除关键时期的酵母杂交cDNA文库，可用于筛选调控芍药种子休眠解除相关基因的转录因子及互作蛋白。本文库的构建可为丰富芍药种子休眠调控研究提供科学支撑，能为芍药栽培育种和野生资源保护及利用奠定分子理论基础。【方法】本研究以休眠解除过程中5个关键时期的芍药种子为试验材料，进行总RNA的提取和m RNA的分离，使用gateway方法构建cDNA初级文库，再通过LR重组，将初级文库重组到pGADT7-DEST次级文库载体上，构建出次级文库，最后经过酵母转化试验，将次级文库质粒转化到酵母Y187感受态细胞中，构建出芍药种子休眠解除过程的酵母文库。【结果】经鉴定，cDNA初级文库库容量为1.28×107 CFU，平均插入片段长度在1 000 bp以上，重组率为100%;cDNA次级文库库容量为1.12×107 CFU，平均插入片段长度在1 000 bp以上，重组率为100%；酵母文库滴度为7.0×107 CFU/mL，平均插入片段长度在1 000 bp以上，重组率为96%。23个阳性克隆测序结果经NCBI比对后，按照功能将20个已知蛋白序列划分为8类，其中7个序列已被报道参与种子的休眠与萌发。【结论】芍药种子休眠解除过程的酵母杂交cDNA文库构建的质量较高，具有较完整的基因信息，符合酵母文库筛选试验所需的标准，为构建芍药种子休眠解除过程的分子调控网络提供基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘严 张怡 康静敏 刘柯 张超 李鹏坤 安一博 周晗 黄辉 李成伟
为了研究番茄白粉菌与番茄相互作用的分子机制,以白粉菌诱导的番茄叶片为材料,利用SMART技术构建了番茄的AD-c DNA文库。该文库总库容量为3.77×1010cfu,重组率达到96%,插入片段长400~2 000 bp,平均长度约为1 000 bp。随机挑取50个克隆进行测序,利用生物信息学软件进行初步分析,表明获得的文库质量较高。
[期刊] 水产学报
[作者]
龚小玲 鲍宝龙 杨桂梅 任大明
在前期的研究中,克隆到牙鲆变态早期和变态前差异表达的parvalbumin基因片断cDNA。为了克隆parvalbumin基因的全长cDNA,构建了变态早期(孵化后23d仔鱼)牙鲆头部的全长cDNA文库,并对文库的滴度和插入片段大小进行了评估。同时采用锚定PCR法从cDNA文库筛选出parvalbumin基因的全长cDNA。结果表明,所构建的牙鲆变态早期头部cDNA文库的滴度为1.2×106PFU·mL-1,插入片段的平均长度为1000bp左右。parvalbumin基因的全长cDNA的长度为603bp,编码109个氨基酸,含有两个EF手型钙离子结合域:DQDGSGFIEEEEL(52～64)...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
周国岭 杨光圣 傅廷栋
综述了基因克隆常用技术包括图位克隆法、转座子或T DNA标签法、同源序列法、表达序列标签(EST)法和差异表达基因分离方法的原理、应用、应用的潜力和限制因素
[期刊] 农业现代化研究
[作者]
何谓“克隆”及克隆技术“克隆”是英文单词“Ｃｌｏｎｅ”的音译，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，这个系胞系中每个细胞的基因彼此是相同的。该词既可作名词解释为“无性系”，又可作动词解释为“使无性系”。克隆技术在现代生物...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭强 吴昌银
为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350～2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
钱瑜 刘同坤 侯喜林 李英
[目的]构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库,筛选与细胞色素C还原酶铁硫蛋白(BcRISP1)互作的蛋白。[方法]从不结球白菜Pol胞质雄性不育花中提取总RNA,通过长距离PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA)。采用SMART建库技术构建不结球白菜Pol胞质雄性不育花全长cDNA文库。利用BcRISP1基因的开放阅读框,构建诱饵表达载体pGBK T-7-BcRISP1转化AH109酵母菌,根据酵母双杂交技术筛选出与BcRISP1互作的片段,并进行质粒共转化验证。[结果]经检测,文库的转化率为每μg p GADT7-Rec 1.80×106转化子,文库滴度为1.21×10...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王宇秋 李国邦 杨娟 黎良 赵志学 樊晶 王文明
【目的】近年来稻曲病日益严重，但目前对稻曲病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ）与水稻相互作用机制仍不清楚。论文旨在利用水稻感病颖花材料构建酵母双杂交文库并筛选稻曲病菌效应因子互作蛋白，为解析稻曲病菌侵染水稻机制提供理论基础。【方法】以感病水稻ＣｈＵａｎｎｏｎｇ ｈ２ｓ为试验材料，在水稻破口前５—７ ｄ左右，从水稻穗中上部接种ＰｓＢ摇培７ ｄ的稻曲病菌荧光标记菌株Ｐ４，接种１３ ｄ后取颖花进行激光共聚焦观察，收集感病颖花。提取感病颖花总ｒｎａ，使用含有ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）的接头引物反转录Ｃｄｎａ第一链，并ＰＣｒ扩增ｄｓ Ｃｄｎａ，通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收ｄｓ Ｃｄｎａ片段，与载体Ｐ．．．
[期刊] 淡水渔业
[作者]
许晨 周勇 史玉恒 范玉顶 刘文枝 江南 赵建青 曾令兵
为深入研究鲤疱疹病毒Ⅱ型CyHV-2与宿主细胞相互作用机制,以鲫脑组织细胞系(Gibel carp brain,GiCB)总RNA为模板,反转录合成cDNA,扩增获得双链cDNA,与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187,构建了GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库。以CyHV-2 ORF25编码蛋白为诱饵,与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交,筛选与其互作的GiCB细胞受体。结果显示:GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库转化效率为1.03×10~6 CFU/μg,滴度为1.24×10~6 CFU/mL,PCR扩增结果表明文库中插入片段的大小在1.5 kb左右。将表达CyHV-2 ORF25编码蛋白的诱饵菌与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交后,筛选得到与ORF25编码蛋白相互作用蛋白的阳性克隆,为进一步研究CyHV-2的感染机制奠定了前期基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王川 盛鸥 窦同心 李斌 胡春华 杨乔松 邓贵明 董涛 李春雨 易干军 毕方铖
[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白，深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作；最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×10~6和3.2×10~6 CFU·mL~(-1),平均插入片段大小在1 200 bp以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白，其中有2个MADS-box转录因子，3个E3泛素连接酶，2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达，而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白，并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1之间存在明显的互作关系。
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