外源施加植物甾醇衍生物-油菜素内脂的信号物质可以显著提高植物的耐盐性。为了检测过表达编码植物固醇关键酶的smo基因是否能提高目标植物的盐胁迫耐受性,当前研究工作使用子房注射法。首先将植物甾醇生物合成过程中关键酶-甲基甾醇单加氧酶的编码PnSMO1.1基因转移到裂叶牵牛中,构建了该基因的过表达转基因株系。接着以经PCR鉴定验证的转基因植物株系幼苗为实验材料,在0～200 mmol/L梯度NaCl处理条件下,检测了不同株系植物的根长和下胚轴长度等生长参数,以及叶片细胞中丙二醛(MDA)的含量、相对电导率、油菜素甾酮和6-脱氧油菜素甾酮含量等生理指标。结果显示,在100～250 mmol/L NaCl处理下,与野生型(WT)植株或空质粒转化对照(BL)植株相比,过表达PnSMO1.1显著增加了转化植株的根和下胚轴的相对生长量,增强了转基因株系的耐盐性。另外,与WT和BL幼苗相比,在不同的NaCl浓度处理条件下,转基因株系中6-脱氧油菜素甾酮的积累显著增加,但相对电导率(rEC)值、油菜素甾酮的积累量或MDA含量均显著降低。盐渍化、干旱和低温等事件的发生,严重抑制了植物的营养生长和产量。这些结果揭示;过表达PnSMO1.1基因,可以通过调节细胞内的油菜素内脂化合物积累量的动态,进而保护质膜的结构完整性,显著提高转基因植物的耐盐性。

【目的】NAC转录因子是一类具有多种生物功能的新型转录因子,在植物抗逆响应中发挥着重要作用。本文旨在克隆并研究细叶百合LpNAC6基因在逆境胁迫下的表达模式,探究其在烟草中响应盐胁迫的功能。【方法】本研究采用同源克隆技术克隆得到细叶百合LpNAC6基因,利用生物信息学软件对LpNAC6基因进行分析;通过基因枪法对LpNAC6蛋白进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR的方法分析LpNAC6基因在不同非生物胁迫和不同组织中的表达模式;构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP转化烟草,通过对转基因烟草进行盐胁迫处理验证LpNAC6基因的功能。【结果】LpNAC6基因长909 bp,编码302个氨基酸,存在一个高度保守的NAM结构域,属于NAC基因家族。LpNAC6为不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,有5个糖基化位点和20个磷酸化位点,亚细胞定位在细胞核。LpNAC6基因与黄褐棉的NAC转录因子进化关系最近。细叶百合中LpNAC6基因对ABA、干旱、低温及盐胁迫均有响应。盐胁迫下,过表达LpNAC6基因的转基因烟草其SOD、POD、CAT的活性和叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量均显著高于野生型。【结论】细叶百合LpNAC6基因能够响应ABA、干旱、低温、盐胁迫等非生物胁迫,其过表达能够提高转基因烟草在盐胁迫下的代谢活力和抗氧化酶活性,从而增强烟草耐盐性。

为了研究异源过表达Atvip1基因的高粱对盐碱胁迫的耐受性及相应生长情况,采用NaHCO_3∶Na_2CO_(3 )为5∶1,75 mmol/L,pH值9.63的盐碱胁迫液在高粱三叶一心期处理,在胁迫0,4,12,24,72,120 h对根系的生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及MDA含量进行测定。结果表明:异源过表达Atvip1基因能缓解盐碱胁迫对高粱幼苗生长的伤害,可使幼苗根表面积和根体积增大,根尖数和分叉数增多,高粱主根褐化出现较晚且症状轻,侧根发生早且数量多,在72 h后仍能保证新叶正常伸展,对地上部生长影响较轻。过表达Atvip1基因可提高转基因高粱根系抗O_2~(-·)活力,降低MDA的含量,抗氧化酶活性增强;胁迫早期(4～12 h),SOD、CAT和GR作用明显;胁迫中期(24～72 h),所有酶均发挥作用;胁迫后期(120 h),CAT和GSH-PX起重要作用。盐碱胁迫差异转录组分析中,差异表达基因COG分析表明,防御机制在不同时间段中占比较大,获得抗氧化酶相关差异表达基因42个。异源过表达Atvip1基因可通过缓解盐碱胁迫对光合作用和生长发育的影响,降低活性氧破坏及膜损伤来提高转基因高粱对盐碱胁迫的抗性。

为研究番茄ｍｉＲＮＡ在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用ＲｅＡｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测番茄ｍｉＲＮＡ３９７在非生物逆境（干旱、盐害、ＡＢＡ）条件下的表达量变化，发现Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７响应这些逆境胁迫，尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７过表达载体转入拟南芥中，进行转基因功能验证。结果表明：与野生型相比，转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢，保水能力更好，且在干旱胁迫下，转基因植株的长势明显优于野生型，其最大光合效率、３种抗氧化酶活性ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡｔ均明显高于野生型，同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７能提高拟南芥对干旱．．．

为探究大豆转录因子GRAS家族GmGRAS69基因在植物干旱胁迫中的功能和可能的分子机制。通过氨基酸序列比对和构建系统进化树分析大豆GmGRAS69与其他物种GRAS成员的序列保守性和进化关系。利用荧光定量PCR方法检测GmPP2C69基因在PEG处理的大豆根和叶中的表达模式。接着构建GmPP2C69基因过表达载体，进而利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥；在正常培养和干旱处理条件下观察野生型和转基因拟南芥的生长表型，测定单株鲜质量、叶片相对含水量和地上部可溶性糖含量、抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性及对应的抗氧化酶基因表达水平。结果显示，GmGRAS69基因在PEG处理的大豆植株根和叶中都显著上调，并且在根中响应更显著。此外，成功获得GmGRAS69基因过表达的转基因拟南芥株系，且过表达株系的耐旱性相比野生型拟南芥WT明显增强。干旱处理后，过表达植株鲜质量、叶片相对含水量和可溶性糖含量均显著高于WT;抗氧化酶SOD、POD和CAT活性以及对应基因SOD、POD和CAT的表达水平也显著高于WT。结果表明，大豆GmGRAS69基因在干旱胁迫下表达上调，进而通过激活SOD、POD和CAT抗氧化酶编码基因、增强抗氧化酶活性和增加可溶性糖的积累，赋予转基因植株更强的耐旱性。

为研究生长素信号对植物硝酸盐营养吸收的调控作用,采用扫描离子选择电极技术(SIET)和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR),测定拟南芥野生型Col-0、生长素过表达突变体yuc1-D以及生长素通路缺失突变体axr1-123种株系初始根中硝酸根离子(NO-3)吸收速率以及硝酸盐转运蛋白基因AtNRT1.1表达量的差异,并进一步检测Col-0株系以及硝酸盐转运蛋白突变体nrt1.1株系在正常条件(CK)或施加外源IAA及生长素极性运输抑制剂2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)处理下的NO-3流速和AtNRT1.1基因表达量的差异。结果表明:yuc1-D株系的NO-3吸收速率以及AtNRT1.1基...

Micro RNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小分子RNA。本文克隆了miR156j的前体(peu-MIR156j),并将其转入拟南芥获得35S:MIR156j转基因植株。对转基因植株的鉴定表明,过量表达miR156j增加了拟南芥莲座叶的发生,导致叶片浓密及开花延迟。这一结果表明:同拟南芥、水稻等物种类似,胡杨miR156j主要对植株发育起重要作用,其功能具有保守性。同时发现超表达胡杨miR156j的拟南芥在盐处理下萌发率与生长状况优于野生型,RT-PCR检测显示靶基因SPL6、SPL9及SPL11的表达下调,证明它们被miR156j负调控。基于预测的与逆境胁迫相关的靶基因STRS2...

【目的】研究etr1-1诱导表达对矮牵牛抗灰霉病的作用。【方法】以转GVG:etr1-1矮牵牛为材料,地塞米松(DEX)处理,接种灰霉病菌,通过调查发病程度和定量半定量基因表达分析揭示etr1-1在矮牵牛抗灰霉病中的作用。【结果】与对照叶片相比,DEX处理的矮牵牛叶片表现出延缓衰老和减轻病害的症状。接种病原菌后,DEX处理的叶片发病率增加比例为0,对照叶片为66.77%;DEX处理的叶片平均病斑扩展速率为4.69 mm·d-1,对照叶片为6.29 mm·d-1。qRT-PCR和semi-qRT-PCR基因表达分析表明,DEX处理的叶片etr1-1与Bcact表达呈相反趋势。在DEX处理叶片中,...

【目的】大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的ds RNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,

为进一步研究ＪｓＷＲＫＹ１的生物学功能，构建ＪｓＷＲＫＹ１的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。ＪｓＷＲＫＹ１过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基因ＭｎｓＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ ｓＯＤ、Ｃｎ、ｎＡＤＰＨ ＯｘｉＤＡｓｅ和ＰＲ１的转录水平。与野生型烟草相比，ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验结果显示，ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用。此外，用胶孢炭疽．．．

以转基因和野生型水稻为材料,通过农杆菌介导法将AtNHXS1转到水稻植株中花11号中,分析在盐胁迫下Na+、K+含量的变化,对两者耐盐性进行比较,并对转基因株系进行分子鉴定和转录表达分析。结果表明:PCR初步鉴定得到了20个转基因株系,随机挑选2个PCR阳性株系进行Southern blot鉴定,确定AtNHXS1以单拷贝的形式成功插入到水稻基因组中。耐盐性分析表明,在盐胁迫条件下,转基因水稻植株的生长状况、干质量、鲜质量、Na+含量显著优于或高于野生型水稻植株;此外,300mmol/L NaCl处理下,转基因水稻植株能够正常存活,而野生型水稻5d内几乎全部死亡。将300mmol/L NaCl...

【目的】创制过量表达TaSUT1A的转基因小麦,分析TaSUT1A在转基因小麦中的遗传及其对干旱胁迫的应答反应,选育抗旱的转基因小麦新种质。【方法】采用基因重组技术构建了TaSUT1A表达载体,利用基因枪介导法将该载体转入小麦品种科农199,通过Bialaphos筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用RT-PCR检测TaSUT1A在转基因T3植株中的表达情况,在此基础上,对3个转基因系的T4转基因植株进行抗旱性鉴定和抗旱相关生理指标分析,验证其抗旱能力。【结果】经PCR检测和RT-PCR验证,获得了转TaSUT1A小麦阳性植株,与非转基因对照相比,20%PEG胁迫处理显...

利用矮牵牛基因表达谱芯片筛选出应答低温胁迫的关键基因，从中发现 1 个CCCH型的锌指蛋白基因PhTZF1。通过RT-PCR分离获得该基因的cDNA全长为2 085 bp，预测其编码694个氨基酸，含有2个CCCH型锌指蛋白保守结构域。系统进化树分析发现，PhTZF1与拟南芥AtSZF1相似度最高。利用半定量RT-PCR检测其在根、茎、叶和花中的表达特性发现，正常生长条件下该基因在各组织中的表达都较弱；利用实时定量PCR检测其在低温、干旱、ABA、MeJA、高盐和高渗胁迫处理下的表达情况发现，PhTZF1表现出不同程度的上调，其中对低温胁迫最为敏感且上调倍数最高，初步推测该基因与矮牵牛应答低温...

【目的】高盐胁迫是影响作物产量的主要因素之一,谷子(Setaria italica L.)具有耐逆性强的特点,从谷子中筛选耐盐基因对于利用基因工程的手段培育耐盐作物新品种具有重要意义。【方法】分析谷子AP2/ERF类转录因子类基因SiANT1在豫谷一号幼苗期在高盐、低氮、PEG模拟干旱处理条件下的表达模式;进而利用农杆菌转化法将SiANT1转入模式作物水稻品种Kitaake;分别用0.9%盐水和自来水浸泡过表达SiANT1水稻和野生型Kitaake的种子,观察其萌芽期的表型并统计发芽率;用含0.9%Na Cl的Hogland营养液室内处理水稻幼苗10 d,65℃烘48 h之后称量干重;同时将其种植在大田,在水稻孕穗前用0.9%盐水灌溉一次,统计成熟后过表达SiANT1水稻各株系和野生型的单株籽粒重、株高、单株分蘖数,对其耐盐性进行评价;利用定量Real time-PCR方法,验证分析转基因水稻株系中SiANT1及其可能的下游基因的相对表达情况。【结果】谷子SiANT1蛋白(XP004985124.1,SiANT1)属于AP2亚族,与高粱(XP021318293.1,Sb ANT1)和玉米(XP008658933.1,Zm AP2)亲缘关系较近;豫谷一号中SiANT1的表达受高盐胁迫(100 mmol·L-1 Na Cl)诱导;将SiANT1和LP0471118-Bar-ubi-EDLL载体连接,利用农杆菌转化法将SiANT1转入到水稻基因组中,筛选得阳性T0植株,繁殖两代得T3代种子;自来水浸泡下,过表达SiANT1水稻种子萌发率和野生型相差不大,萌芽率为90%以上;0.9%盐水浸泡下,过表达SiANT1水稻种子萌发明显受到抑制,与野生型相比,过表达SiANT1水稻种子露白推迟,但最终(处理120 h)萌芽率达到80%以上;室内水稻苗期用0.9%Na Cl处理后,过表达SiANT1水稻的单株干重较受体Kitaake增重14.11%—37.42%,在1%水平上呈显著差异;大田水稻成熟后过表达SiANT1株系单株籽粒重较受体Kitaake增产56.12%—76.58%,在5%水平上呈显著差异,单株分蘖数增多、株高增加,但与野生型无显著差异;半定量RT-PCR分析表明,过表达SiANT1的3个水稻株系都在RNA水平上表达SiANT1;定量Real time-PCR结果表明,过表达SiANT1的3个水稻株系间SiANT1的相对表达量有所差异,但较受体而言,都极显著增加,并且其内源耐盐相关基因Os SOS1和Os ZFP182的相对表达量分别较受体提高1.1—1.7倍和1.6—2.3倍。【结论】Os SOS1和Os ZFP182是耐盐相关基因已被证实,SiANT1具有一定的耐盐性,过表达SiANT1水稻可能是通过增加下游基因Os SOS1和Os ZFP182的表达从而提高耐盐性。

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分，在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上，探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因，并在拟南芥中过表达，获得T_3代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型，测定其过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na~+、K~+动态离子流，利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na~+和H_2O_2含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标，揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体，通过瞬时转化烟草，对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】（1）PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸，PePKS5氨基酸序列与毛白杨PtPKS5相似度最高，并且亲缘关系最近。（2）PePKS5定位于细胞质和细胞核中。（3）NaCl处理6 h后，胡杨叶片PePKS5基因表达量上调，72 h后逐渐恢复至正常水平。（4）盐胁迫下过表达PePKS5基因的拟南芥株系（PePKS5-OE10和PePKS5-OE15）的生存率和根长均明显高于野生型（WT）和转空载体（VC）株系。（5）与WT和VC株系相比，PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的POD和CAT活性增强，APX1和CAT2基因的表达量均升高。（6）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的Na~+外排和K~+的内流明显高于WT和VC株系，并且在根尖中积累的Na~+浓度和H_2O_2浓度明显低于WT和VC株系。（7）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的叶绿素相对含量、PSⅡ最大光量子效率、实际光合量子产量和相对电子传递速率均高于WT和VC株系。（8）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15的净光合速率高于WT和VC株系，而胞间CO_2浓度、气孔导度和蒸腾速率均低于WT和VC株系。【结论】过表达胡杨PePKS5基因能够增强拟南芥对Na~+的外排能力，维持植物活性氧的平衡状态，以及保持相对稳定的光合作用能力，从而提高拟南芥的耐盐能力。