【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分，在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上，探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因，并在拟南芥中过表达，获得T_3代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型，测定其过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na~+、K~+动态离子流，利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na~+和H_2O_2含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标，揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体，通过瞬时转化烟草，对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】（1）PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸，PePKS5氨基酸序列与毛白杨PtPKS5相似度最高，并且亲缘关系最近。（2）PePKS5定位于细胞质和细胞核中。（3）NaCl处理6 h后，胡杨叶片PePKS5基因表达量上调，72 h后逐渐恢复至正常水平。（4）盐胁迫下过表达PePKS5基因的拟南芥株系（PePKS5-OE10和PePKS5-OE15）的生存率和根长均明显高于野生型（WT）和转空载体（VC）株系。（5）与WT和VC株系相比，PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的POD和CAT活性增强，APX1和CAT2基因的表达量均升高。（6）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的Na~+外排和K~+的内流明显高于WT和VC株系，并且在根尖中积累的Na~+浓度和H_2O_2浓度明显低于WT和VC株系。（7）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的叶绿素相对含量、PSⅡ最大光量子效率、实际光合量子产量和相对电子传递速率均高于WT和VC株系。（8）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15的净光合速率高于WT和VC株系，而胞间CO_2浓度、气孔导度和蒸腾速率均低于WT和VC株系。【结论】过表达胡杨PePKS5基因能够增强拟南芥对Na~+的外排能力，维持植物活性氧的平衡状态，以及保持相对稳定的光合作用能力，从而提高拟南芥的耐盐能力。

【目的】冷激蛋白（CSPs）是普遍存在于原核和真核生物中的一类蛋白，能够参与冷、干旱和盐等非生物胁迫。在胡杨中，冷激蛋白的抗逆功能还少有研究。本文旨在通过研究胡杨PeCSP1在植物耐盐性中的作用，进一步揭示植物耐盐的生理与分子机制。【方法】参照NCBI数据库信息，使用primer5设计引物，利用Mega7软件进行多重序列比对及进化树分析，利用荧光定量PCR检测基因表达量。以转基因株系PeCSP1(OE1、OE2)，野生型，转空载体为材料，对各基因型拟南芥进行不同盐浓度处理，从生理生化及分子生物学角度研究胡杨PeCSP1在盐胁迫中的响应机制。【结果】胡杨PeCSP1与毛果杨PtCSP1蛋白序列相似度高，亲缘关系较近。在短期盐胁迫下，胡杨叶片PeCSP1基因下调表达。在NaCl(75、100、125 mmol/L)处理后，过表达PeCSP1拟南芥植株种子萌发率和根长的下降幅度高于野生型（WT）和转空载体（VC），而且转基因拟南芥根细胞中Na~+含量显著高于WT和VC。盐胁迫下，WT和VC抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性显著上升，酶活提高的幅度明显高于OE1、OE2。在土培条件下，盐处理12 d后，转基因株系的最大光量子效率未有明显下降，但相对电子传递效率、实际光合量子产量和叶绿素含量受到的抑制作用高于WT和VC。【结论】过表达胡杨PeCSP1负调控拟南芥耐盐性。

【目的】Annexins是原核生物和真核生物中普遍存在的一大类膜联蛋白家族,能够参与氧化胁迫、热胁迫、干旱胁迫和盐胁迫等许多胁迫响应过程。但在胡杨中,对膜联蛋白家族在抗逆性中的作用情况还缺乏了解。本文研究胡杨Anneixn1在植物耐受渗透胁迫和干旱中的作用。【方法】本研究对渗透胁迫诱导的PeAnn1基因表达进行检测,对Pe Ann1进行相关生物信息学分析,与毛白杨、拟南芥、大豆和水稻膜联蛋白基因家族成员进行序列比对和系统进化树分析,以过表达PeAnn1拟南芥(PeAnn1-OE1和PeAnn1-OE2)、Annexin1突变体(atann1)和野生型拟南芥(WT)为实验材料,利用不同浓度甘露醇处理(0、150、200、250、300 mmol/L)模拟渗透胁迫,并对各株系进行土壤干旱和复水处理,测定了不同处理株系的萌发率、根长、叶绿素含量及荧光参数、过氧化氢含量、抗氧化酶活性和基因表达等指标,分析了不同基因型拟南芥的抗旱性。【结果】短期渗透胁迫处理诱导了胡杨叶片中PeAnn1基因的上调表达。PeAnn1基因序列与毛白杨PtAnn1相似度最高,与PtAnn1亲缘关系较近。在甘露醇培养基上,过表达PeAnn1拟南芥的生存率和根长生长受到明显的抑制,且随着甘露醇浓度的升高,差异显著(P <0.05)。复水后,PeAnn1转基因拟南芥光合参数的恢复程度也较低。在渗透胁迫下,转基因植株抗氧化物酶SOD、POD、CAT的活性以及编码基因的表达量显著低于野生型和突变体,不能清除过多活性氧,导致氧化伤害。【结论】以上结果表明,过表达PeAnn1降低了拟南芥对水分逆境的抗性。

Micro RNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小分子RNA。本文克隆了miR156j的前体(peu-MIR156j),并将其转入拟南芥获得35S:MIR156j转基因植株。对转基因植株的鉴定表明,过量表达miR156j增加了拟南芥莲座叶的发生,导致叶片浓密及开花延迟。这一结果表明:同拟南芥、水稻等物种类似,胡杨miR156j主要对植株发育起重要作用,其功能具有保守性。同时发现超表达胡杨miR156j的拟南芥在盐处理下萌发率与生长状况优于野生型,RT-PCR检测显示靶基因SPL6、SPL9及SPL11的表达下调,证明它们被miR156j负调控。基于预测的与逆境胁迫相关的靶基因STRS2...

以构树幼苗根组织和叶组织为实验材料,研究了NaCl胁迫对质膜H+-ATPase活性和表达的影响。结果表明:盐胁迫促进了构树幼苗质膜H+-ATPase活性的提高。随着NaCl处理浓度的升高,根中质膜H+-ATPase的活性呈持续上升趋势,而叶片中表现为先升高后降低的趋势。激光共聚焦和Western blot分析结果显示:NaCl胁迫诱导了质膜H+-ATPase的表达,酶蛋白量的增加可能是NaCl胁迫后构树幼苗H+-ATPase活性升高的原因之一。

为研究番茄ｍｉＲＮＡ在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用ＲｅＡｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测番茄ｍｉＲＮＡ３９７在非生物逆境（干旱、盐害、ＡＢＡ）条件下的表达量变化，发现Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７响应这些逆境胁迫，尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７过表达载体转入拟南芥中，进行转基因功能验证。结果表明：与野生型相比，转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢，保水能力更好，且在干旱胁迫下，转基因植株的长势明显优于野生型，其最大光合效率、３种抗氧化酶活性ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡｔ均明显高于野生型，同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７能提高拟南芥对干旱．．．

为探究大豆转录因子GRAS家族GmGRAS69基因在植物干旱胁迫中的功能和可能的分子机制。通过氨基酸序列比对和构建系统进化树分析大豆GmGRAS69与其他物种GRAS成员的序列保守性和进化关系。利用荧光定量PCR方法检测GmPP2C69基因在PEG处理的大豆根和叶中的表达模式。接着构建GmPP2C69基因过表达载体，进而利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥；在正常培养和干旱处理条件下观察野生型和转基因拟南芥的生长表型，测定单株鲜质量、叶片相对含水量和地上部可溶性糖含量、抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性及对应的抗氧化酶基因表达水平。结果显示，GmGRAS69基因在PEG处理的大豆植株根和叶中都显著上调，并且在根中响应更显著。此外，成功获得GmGRAS69基因过表达的转基因拟南芥株系，且过表达株系的耐旱性相比野生型拟南芥WT明显增强。干旱处理后，过表达植株鲜质量、叶片相对含水量和可溶性糖含量均显著高于WT;抗氧化酶SOD、POD和CAT活性以及对应基因SOD、POD和CAT的表达水平也显著高于WT。结果表明，大豆GmGRAS69基因在干旱胁迫下表达上调，进而通过激活SOD、POD和CAT抗氧化酶编码基因、增强抗氧化酶活性和增加可溶性糖的积累，赋予转基因植株更强的耐旱性。

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。

植物质膜Ｈ～＋－ＡＴＰＡｓｅ（ｅｃ３．６．１．３）是一类普遍存在于细胞质膜上通过水解三磷酸腺苷（ＡＴＰ）产生能量，将细胞质中的氢离子（Ｈ～＋）逆浓度泵出细胞的运输蛋白。植物中的质膜Ｈ～＋－ＡＴＰＡｓｅ由一个多基因家族所编码，其功能涉及到植物生长发育的多个生理过程。通过对全基因组检索在茄科ｓｏｌＡｎＡｃｅＡｅ植物番茄ｓｏｌＡｎｕｍ ｌｙｃｏＰｅｒｓｉｃｕｍ中共鉴定到８个编码质膜Ｈ～＋－ＡＴＰＡｓｅ的同源基因（ｌＨＡ１～８）。生物信息学分析显示：这８个ｌＨＡ基因具有较高的序列相似性和较为保守的外显子／内含子结构特征。实时荧光定量聚合酶链式反应（ｑ ｒＴ－Ｐｃｒ）分析显示，ｌＨＡ１～４在所有被检测的．．．

提取拟南芥总RNA,反转录获得cDNA后PCR扩增获得1 212 bp目的基因AtSTK。将该基因片段构建到PET-32a表达载体,转化大肠杆菌Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达。该基因表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度1mmol/L,诱导时间为4 h,此时融合蛋白表达量最高。该融合蛋白存在于包含体中,经包含体溶解、复性,最终纯化获得了AtSTK融合蛋白,为AtSTK蛋白的理化性质研究奠定了基础。

【目的】盐害作为一类非生物胁迫严重危害了农作物的生存以及产量。Remorin作为一类植物特有的蛋白质在植物适应环境过程中具有重要功能。本研究克隆了胡杨remorin蛋白PeREM1. 3的编码基因PeREM1. 3,并研究PeREM1. 3基因在植物耐盐性中的作用。【方法】笔者将基因构件35S::PeREM1. 3转入模式植物烟草中,在盐胁迫条件下,通过生理生化的方法对表达PeREM1. 3的转基因烟草进行基因功能的分析。【结果】研究显示PeREM1. 3蛋白定位于细胞质膜上,其编码基因PeREM1. 3的开放阅读框(ORF)长600 bp,编码199个氨基酸。胡杨中PeREM1. 3能够响应盐胁迫和渗透胁迫表达上调。结果表明,在烟草中过表达PeREM1. 3明显地提高了耐盐性。过表达PeREM1. 3的烟草转基因株系中抗氧化物酶如SOD、POD和CAT活性显著提高,降低了活性氧水平,调控活性氧平衡。另外植物抗逆相关基因SOS1、HAK、NHA1、VAG1和PMA4的转录水平显著增高,调控K~+/Na~+平衡。【结论】这些结果说明PeREM1. 3蛋白通过维持植物的活性氧平衡和K~+/Na~+平衡来提高植物的耐盐性。

本文研究了胡杨apyrase基因(Pe APY1和Pe APY2)对植物耐盐性的影响。以Pe APY1和Pe APY2过表达拟南芥、拟南芥Atapy1和Atapy2突变体、野生型(WT)拟南芥及空载体(VC)为实验材料,研究盐胁迫条件下的植物根长、相对电导率、细胞活力、H_2O_2水平、eATP浓度、抗氧化酶活性的变化。研究结果显示:低盐浓度(50 mmol/L NaCl)对拟南芥各基因型的生长和生理生化指标没有显著影响;而高盐浓度(100 mmol/L NaCl)抑制了各株系的根长生长、细胞活力和抗氧化

【目的】土壤盐渍化是制约农林资源生产力的主要因素之一。为适应环境，植物会通过启动基因表达及生理和形态结构的变化来减缓盐害。越来越多的研究表明，C2H2型锌指蛋白在植物应答盐胁迫调控网络中扮演重要角色。迄今，关于植物C2H2锌指蛋白生物学功能的研究集中于植物特有的Q型，而对于非Q型C2H2锌指蛋白的认识非常有限。前人从毛果杨中鉴定到109个C2H2锌指蛋白的编码基因PtrZFPs,其中62个编码的蛋白为非Q型锌指蛋白。鉴定、解析耐盐相关C2H2锌指蛋白基因的功能将为深入理解植物应对非生物胁迫的分子机制提供重要资料。通过分析过表达PdbZFP26转基因山新杨的表型以鉴定其功能，本文以期为山新杨抗盐遗传改良提供优良资源及理论基础。【方法】本研究利用实时定量PCR方法分析PdbZFP26的组织器官表达模式及对非生物胁迫和植物激素的响应模式；利用叶盘转化法获得过表达PdbZFP26转基因山新杨，观察转基因和对照株系在盐胁迫处理前后的长势，测定其抗逆生理指标，比较不同株系对盐胁迫的耐受能力。【结果】基于前期表达谱数据分析，从山新杨茎中筛选到一个受盐胁迫诱导表达的C2H2锌指蛋白基因PdbZFP26,该基因编码区为2 061 bp,共编码686个氨基酸。PdbZFP26仅含有一个C2H2锌指结构域，且该结构域中不具备Q型特征基序“QALGGH”。进化树分析显示，PdbZFP26为C型C2H2型锌指蛋白。表达模式分析结果显示，PdbZFP26在茎中特异表达，主要集中在木质部(包含维管形成层);除盐胁迫之外，ABA和BRs会引起PdbZFP26不同程度的上调，其中ABA胁迫诱导的上调幅度最为显著。转基因山新杨表型分析结果显示，盐胁迫条件下，过表达PdbZFP26转基因山新杨的生长明显优于对照，转基因株系的叶绿素含量显著高于对照，MDA和H_2O_2含量明显低于对照，而SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性高于对照。【结论】过表达PdbZFP26可通过增加抗氧化物酶活性来降低过氧化物质的积累，从而提高转基因山新杨对盐胁迫的耐受性。

以野生型拟南芥(WT)和叶柄硝酸盐积累减少的拟南芥突变体atnrt1.4为材料,研究了叶柄与叶片硝酸盐的积累及细胞膜H+-ATPase。采用两相法分离了2种材料细胞膜并测定了细胞膜H+-ATPase活性,通过RT-PCR分析了WT与at-nrt1.4叶柄及叶片中各个细胞膜H+-ATPase基因的表达,并采用Western blot分析了WT与atnrt1.4叶柄及叶片细胞膜上H+-ATPase的蛋白浓度。结果显示:atnrt1.4叶柄硝酸盐积累显著低于WT叶柄,仅为WT的58.6%;atnrt1.4叶柄中细胞膜H+-ATPase基因AHA3、AHA5、AHA10和AHA11的表达比WT显著降低...