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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李烈川 申明 宁彩波 管志强 蒋毅 吴望军 刘红林
［目的］本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。［方法］采用流式细胞术和细胞计数试剂盒（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８，ｃｃｋ８）检测不同浓度（０、５０、１００和１５０μｍｏｌ·ｌ～（－１））过氧化氢处理１２ ｈ对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用和细胞活力的影响；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测微管相关蛋白１轻链３（ｌｃ３，包括ｌｃ３－Ⅰ和ｌｃ３－Ⅱ）和自噬相关蛋白Ｐ６２／ｓＱｓｔｍ１的表达量变化，转染ｇＦＰ－ｌｃ３质粒检测自噬体的数量；利用３－甲基腺嘌呤（３－ｍＡ）提前４ ｈ抑制自噬后再氧化应激１２ ｈ，用流式细胞术检测细胞的凋亡率，ｃｃｋ８检测细胞活力。［结果］氧化应激．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
段银平 薛瑛 周爽 张敏 张宾 李惠侠
[目的]本试验旨在探讨脂肪因子Chemerin在牛卵巢颗粒细胞凋亡与自噬中的作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞并用重组Chemerin蛋白(0.2μg·mL~(-1))处理24 h,采用流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡,通过免疫荧光检测细胞中活性氧(ROS)含量变化,测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;RT-qPCR分析凋亡与自噬相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、P62和Atg7 mRNA表达,Western blot技术检测凋亡与自噬相关蛋白表达情况。[结果]与对照组相比,Chemerin处理卵巢颗粒细胞后,细胞中ROS和MDA含量显著上升(P<0.05),SOD和GSH-px活性极显著降低(P<0.05)。[结论]Chemerin可通过调控相关基因的表达诱导牛卵巢颗粒细胞凋亡并伴随自噬的发生。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曹秋瑜 姚望 杜星 潘增祥 李齐发
[目的] 了解猪DCN基因的序列特征、蛋白结构和性质，探讨其在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用。[方法] 利用PCR扩增和测序技术获得猪DCN基因编码区序列，并进行生物信息学分析；利用双酶切法构建猪DCN基因的过表达载体，瞬时转染至体外培养的猪卵巢颗粒细胞中，利用qRT-PCR和western blot技术检测其mRNA和蛋白水平；利用流式细胞术检测猪卵巢颗粒细胞凋亡率。[结果] 猪DCN基因编码区核苷酸序列与哺乳动物其它物种在进化过程中比较保守。猪DCN基因编码蛋白含有360个氨基酸，有糖胺聚糖附着位点（GAS）、亮氨酸重复序列N端结构域（LRRNT）和12个富亮氨酸重复序列（LRR）等重要的保守结构域。猪DCN蛋白三级结构呈马蹄铁形状。成功构建了猪DCN基因真核生物表达载体，转染体外培养的猪卵巢颗粒细胞后发现，DCN过表达显著促进了猪卵巢颗粒细胞凋亡率，显著上调了促凋亡基因BAX与凋亡标志蛋白cleaved-Caspase3的表达水平，而BCL-2/BAX比值则显著降低。[结论] DCN基因在哺乳动物的进化过程中比较保守，是猪卵巢颗粒细胞的促凋亡因子。
关键词：
猪 DCN基因 卵巢颗粒细胞 细胞凋亡
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王思琪 周春雪 李玉琦 杜星 潘增祥 李齐发
【目的】探索miR-34a诱导GCs凋亡的RNA激活机制，为揭示猪卵泡闭锁的分子机理、筛选调控母猪繁殖的小核酸调节物提供依据。【方法】利用生物信息学方法分析猪miR-34a特征及其与潜在靶基因lncRNA NORHA启动子的结合情况。利用核质分离技术分析猪GCs中miR-34a的亚细胞定位。qPCR检测miR-34a对猪GCs中NORHA、凋亡标志基因BCL-2和BAX表达的影响。利用荧光素酶活性分析验证miR-34a对NORHA启动子转录活性的靶向调控关系。利用染色质免疫沉淀（ChIP）检测miR-34a对猪GCs中NORHA启动子miRNA反应元件（MRE）处AGO2和组蛋白修饰因子富集情况。利用western blot和流式细胞术分析miR-34a通过NORHA对下游因子FOXO1的表达和细胞凋亡的调控作用。【结果】猪miR-34a为基因间miRNA，其序列在哺乳动物中具有高度保守性。亚细胞定位分析显示，miR-34a在猪GCs中细胞核与细胞质均有分布。生物信息学分析显示miR-34a的MRE位于NORHA启动子-194 nt至-173 nt处，且两者结合自由能为-23.9 kcal·mol~(-1)。qPCR结果表明miR-34a显著上调猪GCs中NORHA的表达。荧光素酶活性分析显示，miR-34a极显著上调NORHA启动子报告载体活性，而对MRE突变型启动子活性没有显著影响。ChIP试验显示，miR-34a可增加NORHA启动子MRE处RNA诱导转录激活（RITA）复合物核心成员AGO2和转录激活型组蛋白H3K4me3的富集，而减少转录抑制型组蛋白H3K9me3的富集。共转试验显示，敲减NORHA可显著或极显著逆转由miR-34a过表达引起的FOXO1蛋白水平和早期凋亡率的上调，以及BCL-2/BAX比值的下调。【结论】细胞核miR-34a是猪GCs中的内源性小激活RNA(saRNA)，通过靶向激活促凋亡lncRNA NORHA的转录，诱导猪GCs早期凋亡（细胞膜完整），可能参与猪卵泡闭锁的启动。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨方晓 李莲 赵若含 王根林
[目的]本文旨在探讨HT-2毒素对牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响,并评估褪黑素(Mel)是否能减弱HT-2毒素对颗粒细胞的毒性作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞,使用0、5、25、50、75和100 nmol·L~(-1) HT-2毒素分别处理细胞24 h,或使用褪黑素(100μmol·L~(-1))预处理12 h后再用HT-2毒素(50 nmol·L~(-1))处理24 h。采用CCK-8检测细胞增殖,用细胞免疫荧光技术检测细胞自噬,用RT-qPCR分析内质网应激与自噬关键基因CHOP、GRP78、Atg7和p62 mRNA表达,用Western blot检测内质网应激和自噬相关蛋白的表达。[结果]与对照组相比,HT-2毒素可导致卵巢颗粒细胞的增殖并呈浓度依赖性减少。免疫荧光染色显示HT-2毒素诱导的细胞自噬呈浓度依赖性增加(P<0.01)。褪黑素预处理显著减轻了HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬。[结论]HT-2毒素可诱导牛卵巢颗粒细胞的内质网应激和自噬并呈浓度依赖性增加,褪黑素可以缓解HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李丽莹 何颖婷 钟玉宜 周小枫 张豪 袁晓龙 李加琪 陈赞谋
【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素，卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因，因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1(catenin beta 1, CTNNB1)对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响，为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR(Quantitative real time PCR, qRT-PCR)等方法，构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱；检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA，转染至猪卵巢颗粒细胞，采用EdU、Annexin V-FITC/PI双染、ELISA等方法，检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响，以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比，CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪；卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调；且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是，CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖，抑制颗粒细胞凋亡；CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平，下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平，进而促进颗粒细胞雌激素的分泌，抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌，抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌，进而促进卵泡的生长发育。
关键词：
猪 卵巢 卵泡 颗粒细胞 CTNNB1
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李惠民 胡洁 贺军民
【目的】研究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)催化产物磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)对紫外线B(UV-B)诱导保卫细胞中过氧化氢(H2O2)产生和气孔关闭的影响,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以蚕豆(Vicia faba L.)表皮条为材料,采用PI3K的抑制剂沃曼青霉素(WM)和LY294002(LY)来抑制PI3P的形成,采用二苯基碘(DPI)和水杨基氧肟酸(SHAM)分别抑制H2O2形成的NADPH氧化酶途径和细胞壁过氧化物酶途径,通过气孔开度分析和激光扫描共聚焦显微镜技术,确定PI3P在0.8 W·m-2UV-B辐射诱导蚕豆保卫细胞H2O2产生和气孔关闭中...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姚晓磊 王汉斌 刘智琳 张艳丽 魏宗友
[目的]本文旨在探究长链非编码RNA（long no-coding RNA，lncRNA）MSTRG.96141.1转录本表达特征及参与湖羊卵巢颗粒细胞凋亡（granulosa cell，GC）的调控机制。[方法]挖掘课题组前期高低繁湖羊(高繁，High prolificacy FecBB，HPBB；低繁，Low Prolificacy FecBB，LPBB)健康优势卵泡（> 5 mm）全转录组测序数据，鉴定到差异miR-3957-3p，采用生物信息学、双荧光素酶报告等方法确定与miR-3957-3p存在靶向关系的lncRNA；在此基础上，以湖羊GC为模型，采用过表达/干扰、qRT-PCR、FSIH、细胞流式术等技术，分析其表达特征和对湖羊GC凋亡的影响。[结果]miR-3957-3p表达水平HPBB组显著低于LPBB组；lncRNA（MSTRG.96141.1）与miR-3957-3p存在靶向关系；该转录本在湖羊生殖器官中的卵巢上表达最高，HPBB组显著高于LPBB组；进一步在湖羊卵巢GC中检测到该转录本的阳性信号，且定位于GC细胞质；干扰MSTRG.96141.1上调BAX基因mRNA表达水平和BAX:Bcl-2比率，进而促进湖羊GC凋亡；过表达miR-3957-3p上调BAX基因mRNA表达水平和BAX:Bcl-2比率，下调Bcl-2基因mRNA表达水平，进而促进湖羊GC凋亡；干扰miR-3957-3p则与之相反。[结论]MSTRG.96141.1通过吸附miR-3957-3p参与调控湖羊GC凋亡，进而影响卵泡发育。而MSTRG.96141.1能否作为湖羊繁殖力的分子标记，还需要进一步探究。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁逍 刘琳 陈迪 马海田
为了建立体外模拟氧自由基诱导的细胞氧化损伤模型,本试验采用Percoll密度梯度离心法纯化原代大鼠Leydig细胞,并鉴定特异性蛋白3β-HSD;采用MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、ROS以及O·-2含量,比色法测定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT和POD的活性。结果显示:特异性蛋白3β-HSD鉴定后,荧光显微镜观察到大部分细胞呈现特异性荧光。MTT测定结果显示,300~1 000μmol·L-1H2O2处理细胞均可极显著降低细胞活力(P<0.01);300μmol·L-1H2O2处理可显著提高Leydig的凋亡率以及增加ROS含量(P<0.05)...
关键词：
H2O2 睾丸间质细胞 氧化损伤
[期刊] 中国农业科学
[作者]
齐放军 高世强 吴茂森 何晨阳
目的本文研究了信号分子一氧化氮(NO)和过氧化氢(H2O2)对水稻细胞过敏反应(HR)的诱导作用。方法用溴酚兰染色法定量检测这两种信号分子单独或协同诱导作用下水稻细胞的HR。结果该两种信号分子可以独立或协同诱导水稻细胞HR的产生,H2O2对NO诱导的HR具有调节作用,但NO与H2O2浓度平衡与否对HR诱导并无影响。结论H2O2和NO均是诱导水稻细胞HR的信号分子,诱导过程中并不存在“NO/H2O2浓度平衡作用机制”。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邬静 袁慧 彭双清
为研究大鼠卵巢颗粒细胞(GC)的分泌功能,用氯丙嗪染毒体外培养的大鼠GC,采用MTT法检测细胞相对活力,ELISA法检测收集培养液中孕酮(P)和雌二醇(E2)的含量,半定量RT-PCR检测激素分泌相关调控基因FSHR、StAR、P450scc和P450arom mRNA的表达,免疫细胞化学染色法检测细胞中特异卵泡刺激素受体的表达。结果表明:经0.1、1.0和10.0μmol/L氯丙嗪染毒24 h后,与对照组相比,细胞相对活力分别为87.95%、83.96%和74.48%,E2的分泌量和StAR mRNA相对表达水平分别从对照组的6.16 pg/μg、2.014显著下降到3.70 pg/μg、0...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
江中良 胡建宏 史怀平 王立强 李青旺
【目的】研究体外培养牛卵巢颗粒细胞中Sprouty基因(Spry)的表达,探讨成纤维细胞生长因子1(FGF1)对Spry基因表达的影响。【方法】从屠宰场收集牛卵巢,剪下直径2~5 mm的卵泡,机械破碎卵泡后收集颗粒细胞进行体外培养,在培养的第5天用FGF1和PD98059处理培养的颗粒细胞,然后用Trizol提取细胞总RNA,利用牛特异性引物进行实时定量PCR检测,用ΔΔCt方法计算Spry基因的相对表达量。【结果】牛卵巢颗粒细胞可以表达Spry基因;Spry基因的表达与FGF1呈现剂量依赖关系,Spry2和Spry4的表达量随FGF1作用时间的延长呈现出先上升后下降的变化趋势;FGF1信号通...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵芳 任守文 赵为民 付言峰 李碧侠
构建猪ＳＩＲＴ１基因全长编码区（ｃｏｄＩｎｇ ＲｅｇＩｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｃｄＳ）的真核表达载体，转染猪原代卵巢颗粒细胞，探讨ＳＩＲＴ１基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中ＡＭＰＫ基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明，猪ＳＩＲＴ１基因的ｃｄＳ区全长大小为２ ２２９ ｂＰ，与ｎｃｂＩ发布的猪ＳＩＲＴ１基因Ｍ ＲｎＡ序列（ｅｕ０３０２８３．２）一致；转染Ｐ ｅｇＦＰ–ｃ１–ＳＩＲＴ１载体的颗粒细胞中ＳＩＲＴ１的Ｍ ＲｎＡ表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组（Ｐ
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
于昊 李曼曼 薛洋 姜志洋 茆达干
［目的］本试验旨在研究毛喉素（FSK）对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及其机制。［方法］体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞，预培养24 h。应用FSK（10 nmol·L~(-1)）处理细胞48 h，检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达；处理96 h检测孕酮（P_(4)）水平及类固醇合成相关蛋白的表达。［结果］与对照组相比，FSK改变了细胞形态，增大了细胞直径，并使细胞内脂滴含量增加（P < 0.01）；FSK降低了细胞的增殖活性和增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA的表达水平（P < 0.01）；FSK降低了颗粒细胞标记基因促卵泡素受体（FSHR）mRNA的表达水平，提高了黄体细胞标记基因前列腺素受体（PTGFR）和促黄体素受体（LHCGR）mRNA的表达水平（P < 0.01）；FSK促进了P_(4)分泌，提高了类固醇合成相关蛋白StAR、P450scc和3β-HSD的表达水平（P < 0.01）；从细胞周期看，FSK降低了细胞周期素B1（CCNB1）、细胞周期素D1（CCND1）和细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）基因的表达（P < 0.01），而使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A/B（P21~(cip1)/P27~(kip1)）基因表达上调（P < 0.01），并将细胞周期阻滞在G0/G1期。［结论］FSK能够通过抑制细胞增殖、增强脂滴积聚和孕酮合成代谢、退出细胞周期来促进颗粒细胞向黄体细胞转化。
关键词：
毛喉素 猪 颗粒细胞 分化 细胞周期
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
陈颖 杨华 乐利 林芳芝 罗永亚 王俊霖 曹福亮
以银杏悬浮细胞为研究材料,通过向液体培养基中添加0~20.0 m M的H2O2,探讨H2O2处理下银杏细胞黄酮代谢、抗氧化酶及活性氧之间的相互关系。主要结果有:1外源H2O2处理限制了悬浮细胞的生长,但提高了苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性(20 m M第6 d除外)和总黄酮的合成,最高达18.8 mg/g DW(10.0 m M处理)。2低浓度(0.5~1.0 m M或0.5~5.0 m M)的H2O2能够激活SOD和CAT酶,而高于5 m M以上抑制两酶活性,POD活性在10~20 m M较高。0.5~1.0 m M外源H2O2对细胞内源H2O2和MDA(第6 d的20m M除外)的积累影响不...
关键词：
银杏 悬浮细胞 过氧化氢 黄酮 抗氧化酶
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