为探索辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)的分子杂交技术检测方法,以感病辣椒叶片为试材,用改良CTAB法从辣椒叶片中提取总核酸,运用RT–PCR技术扩增出PMMo V特异片段。以带有PMMo V特异片段的质粒DNA为模板,以用PCR技术制备的地高辛标记PMMo V c DNA探针检测PMMo V。结果表明:1)干燥叶片、新鲜叶片中提取的总核酸稀释80、640倍(相当于12.5、1.60μg叶片)后仍可检测到其中的PMMo V;干燥叶片利于保存及长距离转运,利于对大批量样品进行集中检测;2)采用快速提取法提取叶片总核酸,可从稀释80倍(约12.5μg叶...

为探索分子杂交技术在草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)检测中的运用,利用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸,并以此为模板,利用特异引物扩增SMoV非编码区序列,经克隆、测序获得SMoV非编码区序列。系统进化分析结果显示:本研究中的分离物与GenBank中已报道的分离物的亲缘关系较远,独立形成1个小的进化支。以带有病毒特异片段的质粒为模板,运用PCR技术制备了地高辛标记的cDNA探针。以草莓感染SMoV叶片为试材,利用地高辛标记探针可有效检测草莓叶片中的SMoV,草莓总核酸样品稀释10倍后仍可有效检测。

【目的】辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）是世界范围内危害辣椒的主要病毒之一。126 kDa蛋白是PMMoV编码的重要致病因子，但致病机制目前仍不清楚。本研究旨在筛选与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子，为解析PMMoV的致病机制提供理论依据。【方法】首先，通过同源重组法构建诱饵载体pGBK-126 kDa；并以辣椒叶片为试验材料，利用Trizol法提取辣椒叶片总RNA，制备辣椒酵母cDNA文库；之后，使用pGBK-126 kDa对cDNA文库进行筛选，并通过NCBI和Uniprot等对筛选结果进行序列比对和生物信息学功能分析，根据比对分析结果，选取可能参与到植物抗病通路的寄主因子，克隆其全长CDS构建到pGADT7载体，酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补（LCI）进一步验证126 kDa与寄主因子之间的互作；最后，通过瞬时过表达寄主蛋白分析其在PMMoV侵染过程中的作用。【结果】提取获得高质量辣椒RNA，无降解；获得高质量酵母c DNA文库，成功构建诱饵质粒p GBK-126 kDa，筛选得到与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子18个；生物信息学分析结果显示，18个寄主因子广泛参与到植物酶系统、物质及能量代谢调节过程、DNA结合转录过程、激素合成过程以及防御响应等多个通路；选取的其中3个寄主因子（LA2、PDHE1、BXL1）在一对一酵母双杂交互作验证中均存在与126 kDa的相互作用，表明初筛的结果可靠；通过Bi FC和LCI进一步验证了126 kDa与BXL1之间体内外互作；瞬时过表达BXL1发现PMMo V的侵染受到了显著抑制。【结论】成功构建了p GBK-126 kDa诱饵质粒，基于该质粒对酵母c DNA文库进行筛选得到18个互作的寄主因子，广泛涉及植物生命活动过程中的多个通路，筛选结果验证可靠，其中，BXL1存在与126k Da的体内外相互作用，并能够抑制PMMo V的侵染。研究结果可为深入探究PMMo V的侵染机制提供良好的理论和材料基础。

采用鉴别寄主、血清学及ＲＴ－ＰＣＲ检测的方法对采自辽宁省葫芦岛地区的辣椒病毒进行了分离与鉴定，并将克隆得到的病毒ＣＰ基因进行测序及同源性比较。结果表明：该病毒分离物可侵染辣椒（ＣａＰｓｉＣｕｍ ｆＲｕＴｅｓＣｅｎｓ）产生局部枯斑、系统斑驳或花叶；局部侵染普通烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ＴａｂａＣｕｍ）、心叶烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ｇｌｕＴｉｎｏｓａ）、三生烟（ｎｉＣｏＴｉａｎａ ＴａｂａＣｕｍ．ｖａＲ．ｓａｍｓｕｎ）、矮牵牛（ＰｅＴｕｎｉａ ｈｙｂＲｉｄａ）产生坏死枯斑，在曼陀罗（ｄａＴｕＲａ ｓＴＲａｍｏｎｉｕｍ）、洋酸浆（Ｐｈｙｓａｌｉｓ ＰｕｂｅｓＣｅｎｓ）和苋色藜（ＣｈｅｎｏＰｏｄｉｕｍ ．．．

【目的】鉴定山东省辣椒上的主要病毒种类,明确该地区辣椒上的主要病毒病原。【方法】2014—2015年,在山东省临沂、日照、青岛、烟台、潍坊、淄博、济宁、菏泽、聊城、德州共10个市(区)采集253份疑似感病的辣椒植株叶片,提取叶片总RNA和总DNA,利用双生病毒的通用引物(PA/PB)、马铃薯卷叶病毒属通用引物(POL-F/POL-R)及已报道侵染辣椒的主要病毒的检测引物对样品进行PCR、RT-PCR分子检测与鉴定,将扩增得到的目的条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接到pMD18-T载体上,再送至公司进行克隆

【目的】明确辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）在贵州烟草上的发生情况及其与我国其他省份不同ChiVMV株系之间的遗传进化关系，为制定科学合理的防控措施提供依据。【方法】从贵州省贵阳、遵义、安顺和铜仁的烟田采集表现叶片斑驳、皱缩、坏死和花叶等症状的疑似病毒侵染的烟叶样品80份。采用RT-PCR法，设计多种病毒引物对所采集的样品进行检测，对检测出的ChiVMV进一步进行PCR分段扩增以获得贵州烟草ChiVMV的全基因组序列，基于NCBI已公布的所有ChiVMV基因组序列进行序列一致性分析并构建系统发育进化树以研究贵州ChiVMV烟草分离株的遗传进化关系。【结果】RT-PCR检测结果显示，ChiVMV在贵州烟区检出率为37.50%，烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）检出率为48.75%，马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的检出率为35.00%，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）检出率仅8.75%；检测出4种复合侵染类型TMV＋PVY、PVY＋ChiVMV、PVY＋CMV和ChiVMV＋PVY＋TMV，检出率分别为26.25%、6.25%、10.00%和3.75%。PCR分段扩增获得贵州省烟草分离株ChiVMV-GZ（GenBank：OP589298），其与来自四川的番茄分离株（No：KC711055）和四川烟草分离株（No：MK405594）具有较高的序列一致性（98.70%和98.50%）；构建系统发育进化树发现其与来自四川和云南的ChiVMV株系聚为一支。【结论】辣椒脉斑驳病毒在贵州烟草上的为害已日趋严重，应当引起足够重视，本研究在贵州烟草上分离获得分离株ChiVMV-GZ并扩增获得该病毒全基因组；基于遗传进化分析发现，ChiVMV-GZ与来自四川和云南的ChiVMV株系间的亲缘关系最近。

【目的】明确草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)的分子变异特点;探索利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV的方法。【方法】利用RT-PCR扩增SMoV3′非编码区(non-coding region,NCR)和大外壳蛋白(large coat protein,LCP)基因特异片段,并对扩增产物进行克隆测序。利用生物信息学软件分析不同地区分离物变异特点及系统发育关系。参考测序结果,在SMoV基因组保守区设计引物,利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV。【结果】获得了SMoV中国分离物的NCR区和部分LCP基因核酸序列,不同分离物部分LCP基因核酸序列同源性...

依据甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针,经过对反应体系和反应条件的优化,建立了特异、灵敏、高效的SPFMV实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明:该方法能检测到目的病毒,标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.307和0.998,扩增效率为100.6%。最低可检测到约5.46个拷贝的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高2个数量级。建立的实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测,为SPFMV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.

【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析，为甲型香石竹斑驳病毒属（Alphacarmovirus）、乙型香石竹斑驳病毒属（Betacarmovirus）和丙型香石竹斑驳病毒属（Gammacarmovirus）病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析，在依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2，在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列（AATAAATCATAA）形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a，测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度，并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑（Hibiscus rosa-sinensis）样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法，扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因，扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒（angelonia flower break virus,AnFBV）、小花矮牵牛斑驳病毒（calibrachoa mottle virus,CbMV）、香石竹斑驳病毒（carnation mottle virus,CarMV）、天竺葵花碎色病毒（pelargonium flower break virus,PFBV），乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV），丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒（melon necrotic spot virus,MNSV），显示出良好的广谱性。特异性检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒（maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus）、天竺葵线纹病毒（pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus）、香石竹环斑病毒（carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus），健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液，简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液，在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明，测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科（Procedovirinae）病毒的分类情况，且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品，均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法，可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测，结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定，并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。

黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是我国的检疫性有害生物,在广西、辽宁、河北、山东、广东和北京等地均发现疫情,已严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等作物的生产,因此加强该病毒的检测极为重要。目前黄瓜绿斑驳花叶病毒病的检测主要有生物学检测、血清学检测、分子生物学检测及电镜显微观察等方法。笔者对有关黄瓜绿斑驳花叶病毒病的检测技术进行了综述,并分析了现有检测技术的优缺点和应解决的主要问题,探讨了该病毒检测技术今后发展的方向。

【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAM

本研究采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)对新疆巴音郭楞蒙古自治州和静地区9个品种的加工型辣椒种子样品进行9种主要病毒的检测。针对检测呈阳性的病毒,进一步通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),对其基因克隆和序列分析验证。结果表明,检测的辣椒种子中携带CMV、BBWV和PMMo V,以CMV的检出率最高,为55.6%,其次是BBWV,检出率为22.2%,PMMo V的检出率最低,为11.1%。CMV不仅是种子携带的优势毒源,且与BBWV和PMMo V复合侵染。种子传毒试验表明其种子传毒率为4.7%~17.4%。研究发现,辣椒种植地域、辣椒品种(种类)影响种子携带病毒种类、带毒率...

从进口美国大豆中挑选具有典型斑驳症状的种子,在隔离温室内种植。出苗后,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)进行菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus,BPMV)的血清学检测。对BPMV血清学反应阳性的幼苗进一步采用反转录(RT)PCR方法和测序方法进行鉴定。结果从大豆幼苗中筛选并鉴定出菜豆荚斑驳病毒。

采用DAS-ELISA对从泰国进口的6个玉米品种的种子进行玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)检测,结果显示其中1个样品为MCMV阳性,其他品种为阴性。RT-PCR检测结果进一步证实该样品为阳性。对PCR产物进行测序,将分离物序列与已发布的23条MCMV序列进行比对和系统进化分析,结果表明该分离物的序列与中国分离物和泰国分离物的遗传距离较近,同分化在进化树的同一个簇。取5号样品的100粒种子进行DAS-ELISA检测,结果仅有2粒种子为阳性,即MCMV的检出率为2%。