温度是影响蜜蜂发育的关键因子之一.为研究低温胁迫对西方蜜蜂幼虫基因表达的影响,利用高通量转录组测序技术分别对最适发育温度和低温处理的西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫的基因表达情况进行分析,获得差异表达基因(DEGs),并对DEGs进行GO功能分类和KEGG富集分析.结果显示,低温处理后共检测到98个DEGs.GO功能分类显示,DEGs富集在21条二级GO功能注释上,富集最多DEGs的GO功能注释为结合、细胞进程、代谢进程、催化活性;KEGG富集分析显示,上调和下调DEGs分别富集在25和3条通路上,主要包括甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、核黄素代谢、昆虫激素生物合成等代谢通路,以及与信号转导相关的Hippo、Notch等信号通路.qPCR结果显示,转录组测序获得的DEGs IP3K、Ex、CYP18A1、GOD、GCDH表达差异显著.本研究结果揭示西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫主要通过提高抗氧化能力和减慢发育速度应对低温.

利用RNA-seq技术对胁迫中华蜜蜂(简称中蜂)6日龄幼虫肠道的球囊菌及其体外培养进行深度测序,根据基因的FPKM值筛选得到高表达基因(HEGs),进而对HEGs进行GO及KEGG代谢通路(pathway)富集分析.Illumina测序数据经质控和过滤得到100814558条有效读段(clean reads),平均Q30均在93.81%以上.GO富集分析结果显示处理组(Aac T)的HEGs富集于39个GO term,基因富集数最多的是细胞(1872 unigene)、细胞组件(1872 unigene)

基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂中肠转录组数据,在全转录组水平上对意大利蜜蜂的可变剪接基因(alternatively spliced gene, ASG)进行鉴定和分析,旨在揭示ASG在宿主响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫中的作用.在正常意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am10CK)和东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7T、Am10T)样品中检测到可变剪接事件数分别为73 383、85 618、79 813和74 693次,对应的基因数分别为9 586、10 063、9 829和9 622个,平均每个ASG上发生的可变剪接事件数分别为7.66、8.50、8.12和7.76次.各样品的可变剪接事件中外显子跨越的数量最多,分别为4 411、5 247、4 993和4 629个.Venn分析结果显示,Am7CK、Am10CK、Am7T和Am10T中的共有ASG数为9 056个,特有ASG数分别为100、153、275和95个.GO分类结果显示,这些共有ASG分布在50个功能条目,特有ASG分别分布于26、30、33和24个功能条目.KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述共有ASG富集在325个代谢通路,包括内质网蛋白加工、核糖体和RNA转运等;特有ASG分别富集在31、104、126和22个代谢通路.研究结果提供了意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫过程中的ASG数量和种类信息,揭示宿主ASG在胁迫响应中参与了新陈代谢和细胞免疫,为关键ASG的筛选和功能研究建立了数据基础.

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(

利用前期获得的中华蜜蜂(Apis cerana cerana)幼虫肠道转录组数据对东方蜜蜂(Apis cerana)基因组的已注释基因进行结构优化、对未注释的新基因进行预测、分析和鉴定:利用Cufflink软件对reads进行转录本重构,通过与参考转录本序列进行比较,共对3 366个东方蜜蜂的基因结构进行了优化;利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对,共预测出527个东方蜜蜂的新基因,其中234个新基因在Nr数据库中存在注释信息;随机选取12个新基因进行PCR鉴定,有11个能够扩增出符合预期的目的片段,表明多数预测出的新基因真实存在;GO分类和KEGG代谢通路分析结果显示上述新基因可能在东方蜜蜂的生长发育、物质代谢、遗传信息传递等方面具有重要功能。本研究结果丰富和完善了东方蜜蜂基因组的基因结构与功能注释信息,也为新基因的功能研究打下基础。

为探究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称中蜂)与意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,以下简称意蜂)幼虫的球囊菌(Ascospahaera apis)抗性差异产生的原因,利用Venn分析、GO分类分析、KEGG代谢通路分析以及Ka/Ks分析对二者的转录组进行比较研究。Venn分析结果显示,中蜂与意蜂的同源基因有17 656个,归属于8 111个基因家族,二者的特有基因分别有1 158和241个,分别归属于468和86个基因家族。GO分类结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集在38和28个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集于96和21个代谢通路;进一步分析发现中蜂的特有基因富集在内吞作用、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和黑化作用等4个细胞免疫通路,以及MAPK信号通路和Toll-like受体信号通路等2个体液免疫通路,而意蜂仅有1个特有基因富集在MAPK信号通路。Ka/Ks分析结果显示受到强烈正向选择、弱正向选择、中性选择和负向选择的单拷贝同源基因分别有37、281、2 630和3 269个。对受到强烈正向选择的基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析,GO结果显示中蜂和意蜂的单拷贝同源基因富集的GO条目类型相同;KEGG结果显示中蜂的单拷贝基因仅富集在氧化磷酸化。上述结果表明免疫相关基因数量的差异是二者的球囊菌抗性差异产生的重要原因之一,中蜂在与球囊菌的协同进化过程中可能通过提高能量利用从而限制球囊菌的增殖。本研究结果可为阐明中蜂及意蜂幼虫的球囊菌抗性差异产生的分子机制提供参考。

【目的】氟氯苯氰菊酯(flumethrin)属于第二代拟除虫菊酯类杀虫、杀螨剂,应用于蜂群除螨。由于杀螨剂具有一定的毒性,在杀死螨虫的同时也会威胁到蜜蜂的健康。本研究采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)检测氟氯苯氰菊酯处理后的西方蜜蜂工蜂幼虫代谢物,筛选差异代谢物,并分析涉及到的代谢通路,研究氟氯苯氰菊酯对蜜蜂的毒理作用,为蜜蜂饲养提供参考。【方法】控制蜂王在空的工蜂巢脾上产卵12 h,并将产卵区域分为4组,从第5天开始分别给各组小幼虫饲喂含氟氯苯氰菊酯的糖水(0、0.5、5、50 mg·kg~(-1)),剂量从第5天至第8天逐日递增(1.5、2、2.5、3μL),第9天采集幼虫的淋巴液。运用代谢组学中的LC-MS技术分析蜜蜂幼虫的代谢物,结合主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),筛选差异显著的代谢物,并对氟氯苯氰菊酯处理组和对照组间共同差异代谢物进行代谢通路分析。【结果】0.5mg·kg~(-1)组与对照组相比,共有差异代谢物190种,共鉴定87种;5 mg·kg~(-1)组与对照组相比,共有差异代谢物275种,共鉴定97种;50 mg·kg~(-1)组与对照组相比,共有差异代谢物275种,共鉴定131种。从鉴定的差异代谢物中筛选到29种氟氯苯氰菊酯处理组共同差异代谢物,其中16种代谢物上调,12种代谢物下调,1种代谢物在0.5和50 mg·kg~(-1)组中下调,在5 mg·kg~(-1)组中上调。这些差异代谢物包括核糖、嘌呤及其衍生物、脂肪酸及其偶联物等。经代谢通路富集分析,发现差异显著(P<0.05)的代谢通路包括氨基糖和核苷酸糖代谢、药物代谢-其他酶类、α-亚麻酸代谢等途径。【结论】LC-MS技术能够有效地分析氟氯苯氰菊酯影响下蜜蜂幼虫代谢物的变化,氟氯苯氰菊酯会引起蜜蜂幼虫体内尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺、硫唑嘌呤、愈伤酸、9-羟基壬酸、氢过氧化亚油酸等物质含量异常,这些差异代谢物的变化证实了氟氯苯氰菊酯引起蜜蜂体内各种物质代谢紊乱,对这些代谢过程分析可进一步阐释蜜蜂代谢有毒化合物的机制,并为杀螨剂及其他有毒化合物对蜜蜂的胁迫提供理论依据。

【目的】探究饲粮中α-亚麻酸的添加水平对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂幼虫抗氧化活性和免疫能力的影响。【方法】移取1日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫1 200只,随机分为5组,每组5个重复,每个重复48只;其中1组为对照组,饲喂不添加α-亚麻酸的基础饲粮,4组为处理组,分别饲喂α-亚麻酸添加水平为0.02%、0.04%、0.06%和0.08%的饲粮。按照室内蜜蜂幼虫饲养方法,将1日龄幼虫用移虫针移至温度适宜的加入200μL饲粮的24孔细胞培养板内,培养板置于恒温培养箱中(温度33℃,相对湿度55%),试验期间每天更换饲粮。饲养至第6天末或第7天初,幼虫开始有直立或排便现象时,将幼虫转移至提前铺好灭菌纸的24孔细胞培养板内准备化蛹。从饲养第1天开始,每天检查并记录幼虫和蛹的死亡数量,并将死亡个体及时移除,直至未死亡的蛹全部羽化新蜂,记录成功化蛹和羽化新蜂个体数量,统计幼虫化蛹率和羽化率。各组分别取5、6和7日龄幼虫测定抗氧化、免疫、脂质代谢指标及相关基因表达量。【结果】饲粮中α-亚麻酸的添加水平为0.02%和0.04%时,化蛹率和羽化率显著高于与其他处理组(P<0.05),而工蜂幼虫血淋巴中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)含量显著低于对照组,高密度脂蛋白(HDL)的含量却显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中α-亚麻酸的添加水平为0.04%时,工蜂幼虫超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性较对照组显著增加,丙二醛(MDA)的含量显著降低(P<0.05)。饲粮中α-亚麻酸的添加水平为0.02%、0.04%和0.06%时,6日龄工蜂幼虫的溶菌酶(lysozyme)和酚氧化酶(PO)活性显著高于对照组(P<0.05)。饲粮中α-亚麻酸添加水平为0.04%时,6日龄工蜂幼虫脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)活性显著低于对照组(P<0.05)。饲粮中α-亚麻酸添加水平为0.04%时,5和7日龄工蜂幼虫lysozyme和PO相对表达量显著高于对照组,但饲粮中α-亚麻酸添加水平为0.08%时,lysozyme相对表达量会显著降低(P<0.05)。【结论】α-亚麻酸对意大利蜜蜂工蜂幼虫抗氧化活性和免疫能力有一定影响,幼虫饲粮中α-亚麻酸适宜添加水平为0.02%—0.04%。

【目的】研究意大利蜜蜂(Apis mellifera)工蜂幼虫饲料中适宜色氨酸水平,为探明意大利蜜蜂工蜂幼虫发育阶段的色氨酸营养需要提供理论依据。【方法】选用1日龄工蜂幼虫1 008只,随机分为7组,每组3个重复,每个重复48只幼虫,分别饲喂色氨酸水平为7.84、8.84、9.84、10.84、11.84、12.84和13.84 mg·g-1的7种日粮。取5日龄工蜂幼虫虫体测定色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)基因与5羟色胺受体(5-hydroxytryptamine receptors,5-HTR)1、2α、2β、7基因表达量;取6日龄工蜂幼虫虫体测定总蛋白...

【目的】20世纪90年代中国成功培育出的王浆高产蜜蜂(Apis mellifera L.)是当今世界最优良的蜂种,使中国的王浆年产量高达2600多吨,占世界总产量的90%以上,稳居世界第一,通过对该蜂种不同发育日龄工蜂幼虫的蛋白质组进行研究,以探明其发育机理。【方法】采用双向电泳法对王浆高产蜜蜂(Apis mellifera L.)不同发育期的工蜂幼虫进行蛋白质组研究。【结果】在幼虫期6d的发育过程中,2日龄、4日龄、6日龄幼虫中分别检测到了262、418、194个蛋白点。这些蛋白的分子量在12.2～88.2kD的较大范围之间,等电点在pH4.00～9.24之间。有84个蛋白在幼虫期整个发育过...

蜜蜂蜂子发育具有狭温性,偏离最适温度影响蜂子正常发育.为了揭示温度胁迫对蜂子能量消耗的影响,本研究测定了29、31、35、37、38℃条件下,意大利蜜蜂工蜂封盖子不同发育阶段的能量消耗.结果表明:在29℃条件下,封盖子能量消耗受到抑制,但完成封盖期发育会增加糖、蛋白和脂肪的消耗量;31℃条件下,封盖子发育过程中的总糖和总蛋白的消耗也受到抑制,但完成封盖期发育消耗的总能量与35℃相同;37℃条件对封盖子能量消耗无影响;38℃高温胁迫抑制封盖子能量的消耗.

基于前期低温胁迫3日龄封盖子不同时间的转录组数据,对可变剪接基因(ASG)作数量、种类统计和表达谱等分析,进一步解释低温对蜜蜂化蛹影响的分子机制;同时利用rMATS软件及Omicshare在线工具对T18、T36处理组(在20℃低温下分别处理18和36 h)及CK(没有低温处理)的差异基因进行可变剪接(AS)事件分析.结果表明,在各组别(CK与T18、CK与T36、T18与T36)中鉴定出4 971个ASG,产生58 017个AS事件,以外显子跳跃、外显子选择性跳跃和可变3′端剪接3种剪接类型为主.各组别间的共有ASG为4 027个,其基因本体(GO)分类结果显示,这些ASG富集在41条GO条目上;KEGG代谢通路富集分析显示,这些ASG共富集在132条代谢通路上,极显著富集的有Wnt、Hippo、TGF-beta和胞吞作用等信号通路.上述结果表明,低温胁迫可通过ASG介导代谢、生长发育和免疫等多重功能调控蜜蜂的化蛹过程.

【目的】探索意大利蜜蜂（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒＡ ｌｉｇｕｓｔｉｃＡ）工蜂幼虫日粮的适宜亚硒酸钠水平，为意大利蜜蜂工蜂幼虫发育阶段硒的营养需要提供依据。【方法】共取１ ４４０只１日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫并平均分为两批，每批７２０只，一批用于化蛹率、羽化率的测定，一批用于理化指标和分子指标的测定。两批幼虫均按单因素完全随机设计分成６组，对照组饲喂基础日粮，试验组分别饲喂亚硒酸钠添加量为０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍｇ·ｋｇ～（－１）的日粮，每组５个重复，每个重复２４只幼虫。取３、５、７日龄幼虫测定体重、总抗氧化能力（ｔｏｔＡｌ ＡｎｔｉｏｘｉｄＡｎｔ ｃＡｐＡｃｉｔｙ，ｔ－Ａｏｃ）．．．

【目的】长链非编码RNA(lncRNA)在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中lncRNA的表达谱及其作用。【方法】利用RNA-seq技术和链特异性建库方法对意蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7、Am10)进行深度测序,下机的原始数据经过Perl脚本过滤得到高质量有效读段。利用bowtie工具将有效读段比对核糖体数据库,进一步利用Top Hat2软件将未比对到核糖体数据库上的数据比对到参考基因组。利用CPC和CNCI软件对转录本的编码能力进行预测。通过RT-PCR对部分lncRNA进行鉴定。利用edgeR软件进行差异表达lncRNA(DElncRNA)分析,进而预测lncRNA的上下游基因,并对上下游基因进行GO及KEGG代谢通路富集分析。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测DElncRNA靶向结合的mi RNA及mi RNA靶向结合的靶基因,并通过Cytoscape软件构建DElncRNAs-mi RNAs-m RNAs的调控网络。最后,通过RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】Am7和Am10的深度测序分别获得134 802 058和147 051 470条原始读段,经严格过滤分别得到134 166 157和146 293 288条有效读段;共得到3 890个DElncRNA,包括2 005个上调lncRNA与1 885个下调lncRNA。RT-PCR验证结果显示共有8个lncRNA能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的lncRNA真实存在。DElncRNA的上下游基因数为1 793个,它们涉及42个GO条目,包括代谢进程、发育进程、细胞进程、应激反应和免疫系统进程等;这些上下游基因还涉及251条代谢通路,包括碳代谢、嘌呤代谢和脂肪酸的生物合成等物质代谢通路,硫代谢、甲烷代谢和氧化磷酸化等能量代谢通路,Hippo信号通路、Wnt信号通路和Notch信号通路等信号通路,溶酶体、内吞作用和泛素介导的蛋白水解等细胞免疫通路,以及MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和NF-kappa B信号通路等体液免疫通路,上述结果表明DElncRNA在意蜂中肠发育过程中参与物质和能量代谢、细胞生命活动和免疫调控。进一步分析发现TCONS_00020918可通过调控西方蜜蜂王浆主蛋白1编码基因在意蜂工蜂中肠的营养吸收、级型分化中发挥功能。DElncRNA的调控网络分析结果显示DElncRNA与mi RNA、m RNA间存在复杂的调控关系,部分DElncRNA处于调控网络的中心位置且能靶向结合较多的mi RNA,也有部分mi RNA可被多个DElncRNA共同靶向,表明这些DElncRNA可能在中肠发育中发挥重要作用。随机挑取5个DElncRNA进行RT-qPCR验证,结果显示它们的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序数据的可靠性。【结论】差异表达长链非编码RNA(DElncRNA)广泛参与意蜂工蜂中肠的新陈代谢、细胞活动和免疫调控并作为竞争性内源RNA(ce RNA)发挥作用,研究结果为关键lncRNA的筛选和功能研究提供了必要的数据支持。

【目的】通过对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫的差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)及免疫通路进行深入细致的分析,揭示宿主的细胞和体液免疫应答,为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T)转录组数据,按照FDR≤1,P≤0.05和|log2 fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG,利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析,进而对免疫通路富集基因进行统计和分析,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)验证转录组数据的可靠性。【结果】差异分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因;Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示,两个比较组特有的DEG分别为739和853个,共有的DEG为118个。GO分类结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程;富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性;富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路;富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体;涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路,以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢;富集下调基因数最多的前5条分别为m RNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢;涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路,以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-q PCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活,随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成,体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答,揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答,前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用;宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强,但体液免疫较大程度地减弱;泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG,NF-κB信号通路及富集DEG,以及抗菌肽编码基因apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。