为探究转录因子TaMADS2在小麦抗叶锈病中的功能，以TaMADS2基因在亲和/非亲和小麦与叶锈菌互作过程中上调表达，且在非亲和组合中上调表达时期较亲和组合更早为依据，利用BSMV-VIGS技术沉默‘中国春’‘郑麦9023’中TaMADS2基因表达，观察TaMADS2沉默植株的表型以及病程相关基因的转录水平变化。结果表明：在接种叶锈菌后，TaMADS2基因沉默植株较对照相比叶锈菌感染加重，单侵染点处活性氧积累面积减小，菌丝长度增加，发病面积增大，促进了病原菌的生长，减弱了植物的抗性反应；通过qRT-PCR分析发现在叶锈菌侵染早期，病程相关基因TaPR1和TaPR2的表达水平下调。综上，TaMADS2基因可能通过调控抗病相关基因的表达正向调控小麦对叶锈菌的抗性。

应用荧光显微镜、微分干涉显微镜和电镜技术 ,比较研究了洛 10和冀麦 3号及其相应的单基因系L r2 6和 L r3Bg接种小麦叶锈菌后的组织病理学和超微结构特征。洛 10和 L r2 6的组织学表现极其相似 ,呈典型的早期过敏性坏死反应 ,导致侵染结构败育 ;冀麦 3号和 L r3Bg的组织学表现出一定差异 ,锈菌在 L r3Bg上的发展要快于呈现出慢锈特征的冀麦 3号。超微结构研究表明 ,小麦叶锈菌在洛 10和冀麦 3号上的发育受到了程度不同的抑制 ,表现为锈菌和寄主在细胞和亚细胞水平上有一系列变化。过敏性坏死反应和胼胝质的形成是 2个重要的抗锈机制。

在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上,从叶锈菌侵染的小麦叶片中发现在接种后8 h表现高表达量的CDPK2-EST。CDPKs即钙离子依赖蛋白激酶,是植物细胞应对各种生物和非生物胁迫过程中承接Ca2+流变化的重要因素。为进一步研究CDPK2在小麦与叶锈菌互作过程中的表达特性,采用RT-PCR和Western-Blotting技术分别在mRNA水平和蛋白质水平对小麦受叶锈菌侵染后不同亲和性组合中CDPK2的表达谱进行了检测。结果表明,小麦CDPK2基因受叶锈菌侵染诱导,不亲和组合在接种后4 h无论在mRNA水平还是蛋白质水平该基因均表现上调表达,而转录水平的表达量在接种后16 h降至对...

【目的】建立小麦叶锈菌与小麦非亲和互作的基因表达数据库,为从分子水平阐明小麦抗叶锈病机制奠定基础。【方法】对叶锈菌诱导的TcLr19小麦叶片cDNA文库随机测序,利用BLASTx对所得序列进行功能注释,按照Bevan的植物基因功能分类标准进行分类。采用RT-PCR技术,以Actin为参照,对2条信号转导相关基因和3条抗病与防御相关基因进行表达分析。【结果】随机对cDNA文库中756个阳性克隆测序,获得649条高质量EST。对EST序列聚类拼接获得472条非重复序列(Unisequence)。功能分类结果表明,25.2%为未知功能蛋白,21.0%与能量代谢基因相关,17.8%与抗病防御基因及信号...

为研究TaRanGAP2在小麦抵抗叶锈菌侵染的HR诱发中的作用，阐明小麦抗叶锈病分子机制，为小麦抗叶锈病育种给予分子水平的指导。以小麦近等基因系TcLr26及其轮回亲本Tc分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和组合(TcLr26×260)及亲和组合(Tc×260),生物信息学分析发现，TaRanGAP2的CDS全长为1 665 bp,编码554个氨基酸，对其保守结构域进行分析发现TaRanGAP2基因编码的蛋白属于Ran GTPase家族；利用RT-qPCR技术检测TaRanGAP2在这2个组合中的表达情况，发现在不亲和组合中TaRanGAP2表达量出现显著上调；利用烟草瞬时转化系统进行亚细胞定位检测发现TaRanGAP2定位于细胞质；利用病毒诱导的基因沉默技术沉默TaRanGAP2基因表达，在接种叶锈菌后与未沉默植株相比，TaRanGAP2基因沉默植株叶片的单侵染点HR面积显著增大，HMC数量显著增多；结果说明TaRanGAP2基因在小麦抵抗叶锈菌侵染的寄主过敏性反应发生具有重要作用。

【目的】构建小麦与条锈菌亲和互作的差减文库,分离条锈菌侵染小麦过程中的差异表达基因。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌相应毒性小种CY31号为材料,构建条锈菌侵染阶段的SSH-cDNA文库,挑选250个阳性克隆测序并进行生物信息学分析。【结果】聚类后得到149条非冗余EST(unigene)。经BlastX比对和功能分类分析,其中50条unigene(33.6%)未找到同源性匹配,25条(16.8%)与未知功能蛋白同源性较高;其余74条功能已知的unigene中,与初级代谢、能量相关的基因分别有13条和10个,占8.7%和6.7%,感病及防御相关的基因有6个约占4.0%;此外,获得两个与病原菌...

利用化学显微技术和生物电镜技术,系统地研究了小麦秆锈菌在感病寄主上发育过程的组织学及超微结构特征。结果表明:小麦秆锈菌的发育过程可分为几个明显的阶段:孢子萌发和芽管形成,附着胞的形成和气孔下囊的分化,初生侵染菌丝和次生侵染菌丝的形成和生长,吸器母细胞和吸器的形成,夏孢子床和夏孢子堆的产生。小麦秆锈菌菌丝沿着细胞壁生长和蔓延,菌丝顶端细胞原生质稠密,代谢旺盛;吸器母细胞形成在细胞壁周围,吸器产生在细胞里面,呈指状,吸器外围和细胞膜区域有吸器外间质的存在。小麦秆锈菌发育早期,小麦细胞一直保持正常;而在发育后期,小麦细胞发生了质壁分离,叶绿体片层受到破坏。

首次使用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析两种小麦材料近等基因系TcLr19及其感病亲本Thatcher的甲基化水平,同时比较了苗期接种叶锈菌生理品种THTT前后基因组DNA胞嘧啶甲基化模式。60对选扩引物对接种前后的小麦DNA进行全基因组筛选,共得到3 554个片段。其中998个片段是两种甲基化模式中的一种,小麦近等基因系TcLr19及其感病亲本Thatcher的甲基化水平约为28.1%。在所有的引物中,并没有直接分离得到接菌前后的甲基化模式的差异。结果初步表明,叶锈菌可能并没有诱导植物基因组DNA胞嘧啶位点的甲基化模式变化。

【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转...

【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因，明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法，从小麦条锈菌中获得PsSte12基因，利用生物信息学分析其序列特征，实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征；借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12，该基因序列含有1个全长2 553 bp的开放阅读框；基因组DNA序列含有4个内含子，分别位于开放阅读框第281，429，1 512，1 584位，长度分别为7

小麦接种高度非亲和性的小麦秆锈菌后,在其细胞间隙液(IWF)中可能存在激发子。通过硫酸铵沉淀法将其分级,再将各分级沉淀蛋白溶液注射到高度非亲和性互作小麦叶片中,观察过敏性坏死反应(HR)和过氧化物酶(POD)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化。结果表明:激发子成分主要集中在50%~80%硫酸铵沉淀蛋白部分中,能明显诱导叶片发生过敏性坏死反应;40μg/mL的该分级沉淀蛋白溶液处理小麦叶片后,PAL和POD活性在早期已有显著增加,分别在诱导处理后36 h和60 h左右出现最高峰,较对照分别增加了37.47%和78.20%。

由小麦叶锈菌引起小麦叶锈病是我国小麦重要病害之一。为研究小麦叶锈菌流行群体的毒力构成和亲缘关系,利用IGS(Intergenic spacer)特殊引物(L318和5SK)对71个小麦叶锈菌IGS进行扩增检测。结果表明小麦叶锈菌小种间的IGS存在多样性,但多样性与小种毒力之间不存在直接相关性,和小种的区域性有一定的相关性。进一步对差异带型进行分析,获得IGS-1、IGS-2的序列。IGS在小麦叶锈菌种内存在多态性,这有益于开发和建立IGS分子标记,并为研究锈病流行群体结构和追溯年度流行的病原来源,以及该病菌的生物学进化提供依据。同时利用IGS可以预测病害发生的流行群体,进而有针对性的种植抗病品...

【目的】锌指类转录因子在植物逆境信号转导和非生物胁迫响应中发挥重要的作用。通过对小麦锌指转录因子基因Ta Di19A的耐冷性能进行鉴定,利用酵母双杂交技术筛选并获得与Ta Di19A互作的候选蛋白,以解析Ta Di19A介导的抗逆调控机制。【方法】通过对低温处理的小麦转录组测序结果进行分析,获得一个锌指类转录因子Ta Di19A。利用生物信息学的方法分析Ta Di19A的分子特性,用SMART在线工具进行蛋白结构分析;用GSDS和PHYRE2在线工具分别对Ta Di19A结构和蛋白三级结构进行分析;用Ne

【目的】了解小麦受条锈菌诱导后的基因表达情况,从分子水平揭示寄主与病原菌非亲和互作机理。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌CY23号小种组成的非亲和组合为材料,利用SMART技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。随机挑取克隆测序,对其中获得的507条高质量表达序列标签(EST)进行生物信息学分析。【结果】得到原始文库的滴度为1.2×106pfu·ml-1,扩增文库滴度2×109pfu·ml-1,重组率97%,插入片段大小为0.4～3kb。对获得的237个非重复序列进行BLAST分析,已知功能基因大部分与能量代谢、蛋白质合成修饰及加工、转运、信号转导、防卫反应等相关。【结论】该cDNA文库质...

【背景】条锈病是小麦上的重大病害，由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst）侵染引起。条锈菌是活体营养型寄生真菌，在侵染过程中形成吸器，通过吸器从寄主植物汲取营养。同时，吸器分泌效应蛋白调控寄主免疫，促进侵染过程。【目的】明确条锈菌效应蛋白的功能及其作用机理，为揭示条锈菌的致病机制打下基础。【方法】比较分析条锈菌夏孢子、芽管和吸器转录组，获得在吸器诱导表达的分泌蛋白基因Hasp83，在本氏烟叶片细胞中瞬时表达观察是否能抑制由BAX引起的细胞坏死；利用qRT-PCR分析该基因在条锈菌侵染小麦不同阶段的表达水平。借助荧光假单胞菌Ⅲ型分泌系统和寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）分析Hasp83在条锈菌侵染过程中的功能。利用酵母双杂交系统筛选小麦中与Hasp83互作的蛋白，免疫共沉淀技术进一步在烟草细胞中共表达验证Hasp83及其候选靶标蛋白的互作。【结果】Hasp83开放阅读框全长522 bp，编码173个氨基酸，蛋白N端1—29位氨基酸为信号肽，无保守结构域，在本氏烟叶片细胞中瞬时表达能抑制由BAX引起的细胞坏死。qRT-PCR分析显示，Hasp83在条锈菌侵染时期上调表达；利用细菌Ⅲ型分泌系统在小麦水源11品种中瞬时表达Hasp83能够抑制荧光假单胞菌引起的胼胝质积累，在接种条锈菌无毒性小种CYR23后，瞬时表达Hasp83株系产生的活性氧积累面积和过敏性坏死面积相比对照减少19.35%—38.62%；利用HIGS技术在接种条锈菌毒性小种CYR31的小麦水源11中沉默Hasp83，发现条锈菌的产孢量、菌丝长度、菌丝扩展面积和吸器数目减少，致病力降低。酵母双杂交结果表明，效应蛋白Hasp83与其小麦中候选靶标过敏性坏死诱导蛋白Tahir1互作。免疫共沉淀进一步证明Hasp83及其候选靶标Tahir1存在互作。【结论】条锈菌效应蛋白Hasp83可抑制寄主由非致病细菌和无毒性条锈菌生理小种引起的小麦防卫反应，增强病原菌的致病力。