番茄属于冷敏感模式植物，在生长过程中极易受冷害进而影响其产量。为进一步揭示番茄植株抗寒的分子机制以及对选育番茄抗寒品种提供理论依据，以蔬菜遗传育种与生物技术实验室种质资源编号25的番茄品种为材料、番茄转录因子SlMYB-related 2为研究对象，基于CRISPR/Cas9基因敲除载体，通过农杆菌转化法转化获得番茄阳性植株；构建VIGS瞬时沉默表达载体，以野生型和未插入目的基因片段的病毒转化植株为对照，将3组植株进行4℃(16 h光照/8 h黑暗处理，60%湿度)低温处理后，测定抗冷相关生理指标的含量，比较其耐寒性。结果表明，构建了CRISPR/Cas9基因敲除载体，共获得了CRISPR沉默阳性植株2株；构建了VIGS沉默表达载体，经低温处理后发现，随着低温处理时间的延长，SlMYB-related 2基因转化组番茄植株的脯氨酸和可溶性糖的增长趋势比对照番茄组(野生型携带TRV空载，CK)和野生组(WT)慢，且含量低于CK组和野生组，但丙二醛含量高于CK组和野生组，证明VIGS瞬时表达番茄植株抗寒性显著低于CK组和野生组。通过对基因瞬时沉默表达后番茄植株的抗寒性分析，发现SlMYB-related 2基因在低温胁迫中起到了正调控作用。

【目的】筛选并鉴定参与调控桂花Osmanthus fragrans番茄红素β-环化酶OfLCYB基因的B2亚组ERF转录因子。【方法】以桂花品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，从桂花转录组数据库筛选B2亚组OfERF基因，通过生物信息学分析、实时荧光定量PCR (RT-qPCR)以及酵母单杂交技术，对OfERF基因序列和表达特性及其对OfLCYB基因启动子结合情况进行分析。【结果】OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件；基于桂花转录组数据库筛选出4个B2亚组ERF基因，均包含1个AP2保守结构域；RT-qPCR结果表明：OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因表达显著负相关，P分别为0.033 8、0.029 6；酵母单杂交结果证明：OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在物理结合。【结论】OfERF72b可能通过调控OfLCYB的转录参与桂花类胡萝卜素的代谢。图7表3参25

为了研究番茄ＳｌＹＡＢ２Ａ基因的功能及其在番茄生长发育中的分子机理，以番茄的ｃＤＮＡ为模板，利用ＲＴＰｃＲ技术从番茄中克隆到ＳｌＹＡＢ２Ａ基因，该基因编码的蛋白质由１９２个氨基酸残基组成，蛋白质的分子量为２１．３５ｋ ＤＡ，等电点是８．７９，平均亲水系数是－０．４８７。ＳｌＹＡＢ２Ａ蛋白质的６～１６５位氨基酸残基形成ＰｆＡｍ：ＹＡＢＢＹ结构域，在２０～４７位有１个ｃ２ｃ２锌指结构域，在１２２～１８１位有１个螺旋－环－螺旋结构域。二级结构分析表明ＳｌＹＡＢ２Ａ蛋白分子中，α－螺旋占１９．７９％、β－折叠占１４．０６％、其余６６．１５％为不规则卷曲。蛋白多序列比对表明ＳｌＹＡＢ２Ａ与马铃薯、林烟草．．．

【背景】番茄(Solanum lycopersicum)作为连续发芽分化和坐果的重要园艺作物,早衰是限制其生长期长短、产量和品质的重要因素。NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)转录因子家族参与调控拟南芥、水稻等多种植物衰老进程,但在番茄中的研究尚不深入。目前已知,SlNAP2(NAC-like, activated by apetala3/pistillata)参与番茄植株衰老进程。【目的】SlNAC29为SlNAP2的同源基因,对其在番茄植株衰老中的功能及调控机制进行研究,以期为园艺栽培中番茄的衰老调控及种质创新提供科学依据。【方法】以野生型番茄(Condine Red,CR)为背景,采用qRT-PCR技术明确SlNAC29在不同衰老阶段叶片中的相对表达量,并分别利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因过表达技术构建Slnac29纯合突变体及OE:SlNAC29稳定过表达植株。在此基础上,在自然生长状态下和黑暗处理诱导衰老条件下,对野生型、Slnac29突变体和OE:SlNAC29过表达植株的生长、叶绿素含量、光合作用、叶片衰老和叶绿素降解相关基因的相对表达量等参数进行分析,明确SlNAC29转录因子在调控番茄植株衰老中的生物学功能;进一步利用聚类热图分析过表达植株OE:SlNAC29中29个衰老相关基因、叶绿素降解基因以及ABA合成/信号转导相关基因的相对表达量。并选取在黑暗诱导衰老条件下不同株系植株中表达差异明显的4个基因进行凝胶迁移阻滞分析(electrophoretic mobility shift analysis,EMSA),以鉴定SlNAC29直接转录调控的靶标基因及其与衰老调控的关系。【结果】SlNAC29在初老叶和衰老叶片中的相对表达量较嫩叶和成熟叶显著上升。自然生长状态下,突变体材料Slnac29与野生型长势以及光合速率无明显差异,而过表达材料OE:SlNAC29株高则显著低于野生型植株,叶绿素含量和光合速率分别是野生型植株的25%和50%。在黑暗诱导衰老的条件下,野生型植株叶片明显变黄,叶绿素含量显著下降。Slnac29突变缓解了叶片衰老程度,叶片无明显变黄,叶绿素含量是野生型的3倍,衰老相关基因(senescence-associated genes,SAGs)和叶绿素降解基因的表达量均较低。OE:SlNAC29则相反,叶片衰老程度比野生型和Slnac29突变体均明显严重。基因聚类分析表明多个衰老相关基因和叶绿素降解基因在OE:SlNAC29植株中显著上调表达。EMSA鉴定到SlNAC29能够直接与衰老相关基因家族SAGs成员SlAGT1(Glyoxylate aminotransferase)启动子绑定,且SlAGT1在OE:SlNAC29中的相对表达量较野生型和Slnac29突变体显著增加。【结论】转录因子SlNAC29调控番茄植株的衰老,促进番茄叶片在黑暗诱导条件下的衰老进程。SlNAC29直接绑定衰老相关基因SlAGT1启动子区域调控其转录表达。

为进一步明确该基因的分子特征及表达特性,通过RT-PCR从番茄中克隆了低温响应NAC转录因子SlNAC80,该基因开放阅读框1 023 bp,编码340个氨基酸。Sl NAC80蛋白相对分子量为38.19 k Da,等电点为5.27,N-端具有典型的NAC保守结构域,包含A、B、C、D、E 5个亚结构域。实时荧光定量PCR(q PCR)分析表明,Sl NAC80在番茄各组织中均有表达,以在绿果和衰老叶中的表达量最高,在红熟果中的表达量最低。对启动子区序列进行预测分析发现,Sl NAC80启动子区含有许多响应激素(ABA、GA、SA及ETH)和逆境(低温、脱水及盐胁迫)的顺式作用元件,如EREL...

WRKY转录因子是植物中特有的转录因子家族之一，研究证实WRKY转录因子在植物的生长发育及对生物与非生物胁迫响应中具有重要的调控作用。为揭示番茄WRKY基因的功能，基于前期转录组数据，以番茄高抗青枯病Hm 2-2(R)与高感青枯病BY 1-2(S)2个自交系株系为试验材料，克隆得到1个番茄WRKY转录因子SlWRKY75基因(Solyc05g015850.3)。通过生物信息学分析、氨基酸序列多重比对、系统发育树构建、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和病毒诱导的基因沉默(VIGS)等技术方法对其基因及编码蛋白的结构、表达模式与功能进行分析。结果表明，该基因的cDNA全长为653 bp,其最大开放阅读框为519 bp,编码172个氨基酸，其蛋白相对分子量为19.878 51 ku,理论等电点为9.32,属于亲水性非分泌蛋白，且不存在跨膜结构，同时，该蛋白具有1个高度保守的WRKY结构域和一个CX_4CX_(23)HXH锌指基序，且同属于第Ⅱ类家族。系统发育树分析表明，SlWRKY75与潘那利番茄SpWRKY75亲缘关系最近，并与其他茄科聚为1组，而与橡胶树HbWRKY75、陆地棉GhWRKY75等的亲缘关系较远，在系统发育树上处于不同的分支。qRT-PCR结果表明，SlWRKY75基因的表达具有组织特异性，并可被青枯菌、水杨酸和茉莉酸所诱导。利用VIGS技术得出，沉默SlWRKY75降低了植株对青枯病的抗性，表明SlWRKY75正调控番茄对青枯病的抗性。通过以上研究结果得出，SlWRKY75基因在番茄调控青枯病抗性响应过程中扮演着重要的角色。

[目的]本文旨在探究乙烯信号通路转录因子EIL1对番茄果实形成的作用。[方法]以EIL1过量表达转基因番茄(EIL-OX)、EIL1共抑制表达转基因番茄(EIL-CS)、EIL1启动子驱动GUS报告基因的转基因番茄(PE1∷GUS)和DR5启动子驱动GUS报告基因转基因番茄(DR5∷GUS)为材料,采用RT-qPCR和ELISA等技术研究在番茄果实形成过程中EIL1的转录变化和生长素水平变化;通过杂交、Ag+处理以及GUS染色,分析乙烯和生长素在番茄果实形成过程中的互作机制。[结果]RT-qPCR结果显示,在番茄果实形成和成熟的过程中Sl EIL1基因的表达量呈"升高-降低-升高"的趋势。表型分析发现,EIL-OX植株较矮,叶片小且向地生长,出现大量侧枝,部分花蕾凋亡且植株提前衰老; EIL-CS植株自交形成的胚珠发育异常,产生无籽果实,同时ELISA检测表明EIL-CS植株果实发育过程中生长素含量高于EIL-OX和野生型植株。GUS染色结果显示,PE1∷GUS植株EIL1在萼片中大量表达,DR5∷GUS植株生长素主要分布在果柄、萼片处,且授粉后萼片与子房交接处的生长素含量降低。EIL-OX/DR5∷GUS和Ag+处理的野生型植株中生长素主要出现在果柄处。[结论]EIL1能够阻碍生长素从果柄向子房运输,授粉受精或下调表达EIL1均能解除这种阻碍,提高子房生长素水平,形成果实。

为了探索日光温室番茄的最佳定植期,并提出相应的丰产技术对策,从2017年2月27日至2018年1月27日,开展12期的分期定植试验,观测了番茄各生育期的环境因子、生育期和相应产量,分析各生育期因子与产量及生育期的相关性。结果表明:2017年4月27日和2017年5月27日定植的番茄全生育期最短,为105 d,比2017年9月27日定植的番茄全生育期缩短了41. 67%;平均最高气温、平均最低气温、平均气温、白天平均气温、夜晚平均气温、平均昼夜温差、平均土壤温度、平均光照度和平均相对湿度均是影响番茄生育期的关键环境因子。定植-开花期的平均最低气温和平均气温均与番茄产量呈显著负相关,相关系数均为-0. 76;番茄产量与采收-拉秧期的平均昼夜温差、平均光照强度、平均最高气温和平均气温呈显著的正相关关系,且相关系数分别为0. 90,0. 81,0. 75和0. 71,说明温度是影响番茄产量的关键环境因子。通过各处理产量的对比得出,春茬定植期为2018年1月27日定植的番茄产量最高,为127 437. 45 kg/hm~2,其次为2017年12月27日和2017年2月27日,分别为117 674. 25,115 912. 95 kg/hm~2。秋茬定植期为2017年8月27日的番茄产量最高,为62 007. 90 kg/hm~2,其次是2017年9月27日,为54 532. 95 kg/hm~2。说明宁夏日光温室春茬番茄的最佳定植期是12月下旬-翌年2月上旬,该时期内环境因子有利于番茄产量的形成。秋茬番茄的最佳定植期是8月下旬-9月上旬,该生育期内,可通过降低定植-开花期的气温,增加采收-拉秧期的温度和光照强度,从而提高番茄的产量。

以Ｍｉｃｒｏ－ＴｏＭ番茄（ＳｏｌａｎｕＭ ｌｙｃｏｐｅｒＳｉｃｕＭ ｌ）为材料，构建ＳｌＭｙＢ１２ ｒｎａｉ载体，利用农杆菌介导法导入番茄；对转基因植株评价发现，ＳｌＭｙＢ１２基因被干扰后植株出现了植株矮化、果实变小、种子数减少和转色期提前等变化；实时荧光定量ｐｃｒ检测表明干扰植株果实中类黄酮路径相关基因ＳｌｃＨＳ、ＳｌＦ３Ｈ、ＳｌＦ３’Ｈ表达量下降，ＳｌｃＨｉ基因表达量上升。

番茄果实成熟衰老是一个有序而复杂的过程,也是一个多因子高度协调的遗传调控过程,影响番茄果实成熟衰老的因子很多,包括各种植物激素﹑相关酶类以及各种外源物质等。本文论述了与番茄果实成熟衰老相关的植物激素及其类似物(乙烯﹑脱落酸﹑水杨酸﹑茉莉酸﹑多胺)﹑相关酶类(脂氧合酶﹑保护酶类﹑软化酶类),以及外源物质(1-甲基环丙烯﹑一氧化氮﹑钙)对番茄果实成熟衰老的影响,并探讨了各种相关因子对其成熟衰老的影响机理。

为解析环境因子耦合对番茄光合作用及生长的驱动和调控作用,实现温室番茄生长环境精准管理。对温室内空气温度、相对湿度、光合有效辐射采用二次正交旋转设计组合,分析环境多因子耦合对结果期番茄生长及光合作用调控效应。以番茄相对生长速率和净光合速率综合最优为评价目标,建立生长光合复合评价指标对环境多因子的综合响应模型。结果表明:环境多因子对番茄相对生长速率、净光合速率的调控效应和路径不同。单因子效应分析表明空气温度、相对湿度与相对生长速率关系均为开口向上抛物线,但与净光合速率关系均为开口向下抛物线。边际效应分析表明,对相对生长速率,3种环境因子均为正效应;对净光合速率,空气温度、相对湿度为负效应,光合有效辐射为正效应。通径分析表明,相对生长速率的主控因子为叶绿素含量、净光合速率,受环境因子的间接调控;净光合速率的主控因子为植株含水量,叶绿素含量,受环境因子的直接调控。生长光合复合指标响应模型中,温度与湿度、温度与光照均存在显著负交互作用,表明光照强或湿度大时提高空气温度会抑制番茄生长。综合考虑番茄生长及光合作用,秋冬及早春季节温室结果期番茄最适生长环境为温度29.2℃,湿度75%,光照400μmol·m~(-2)·s~(-1)。

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子(VEGF)的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390R-VEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有...

【目的】对葡萄转录因子VvERF2进行蛋白质生物信息学分析，利用基因克隆、同源遗传转化技术，探索该转录因子在葡萄愈伤组织盐胁迫下的功能，为进一步研究AP2/ERF超家族对葡萄的作用机理提供参考。【方法】借助NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等在线数据库工具对VvERF2蛋白进行生物信息学分析；以‘无核白’葡萄（Vitis. vinifera L.）愈伤组织为材料，构建葡萄VvERF2同源遗传转化体系，结合生长量、总糖、总酸等理化指标鉴定转基因愈伤组织表型；设定不同盐浓度梯度，通过游离脯氨酸、抗氧化酶活性等生理指标鉴定转基因愈伤组织耐盐功能。【结果】对VvERF2及一致性最高的7个直系同源蛋白序列进行生物信息学分析，发现VvERF2编码240个氨基酸，与番茄、无花果氨基酸序列高度相似，蛋白同源性分别为78%和67%。8种不同物种的氨基酸残基数为240—348个，分子量为26.43—38.60 kDa，理论等电点在5.54—8.68，脂肪氨基酸指数均大于66%，均属于不稳定性蛋白；不同物种氨基酸序列理化性质存在差异较大。此外，VvERF2启动子存在多种与脱落酸等激素及MYB等转录因子相关的顺式作用元件。VvERF2具有组织表达特异性，在愈伤组织中表达水平最低，且受外源盐胁迫诱导显著上调（为对照组的3倍）。转基因结果表明，VvERF2在葡萄愈伤组织中过量表达后，生长量、总酸、总酚含量及DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，1,1-Diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine)等抗氧化活性均显著升高，不同浓度外源NaCl处理后，转基因愈伤组织总蛋白、游离脯氨酸等含量均高于野生型愈伤组织。【结论】VvERF2过量表达促进葡萄愈伤组织生长量和次生代谢产物相关物如酚类物质的含量积累，从而提高葡萄耐盐性。

【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast growth factor-21,FGF21),为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi)作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ(简写为p1390RⅡ)上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)"中蔬6号",采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转...

为弄清Sly-miR1917以及其靶基因SlCTR4sv3在番茄生长发育和响应外界刺激中的表达模式,以中蔬6号番茄(Solanum lycopersicum L.Zhongshu 6)为试材,实时荧光定量PCR检测Sly-miR1917和SlCTR4sv3在番茄不同组织部位的表达,并结合生物信息学分析Sly-miR1917和SlCTR4sv3启动子顺式作用元件,调查了二者对相应激素和非生物胁迫的响应模式。此外,为进一步明确靶基因是否对Sly-miR1917存在反馈调控机制,应用Gateway重组技术将Sl