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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
邓云涛 方浩 史鹏
【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P_(AOX1)诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除Mit1后,GFP几乎不能发出荧光。实时荧光定量PCR结果显示,在甲醇和甘油2种碳源下,敲除Prm1后Mit1少量表达,敲除Mit1后Prm1大量表达。【结论】利用P_(AOX1)诱导型过表达Prm1、Mit1和利用P_(GAP)组成型过表达Mit1,均能提高GFP在毕赤酵母细胞内的表达量。Prm1和Mit1可作为正调控因子在毕赤酵母产外源蛋白中发挥作用,且Prm1能激活Mit1,Mit1可反馈抑制Prm1。
关键词：
毕赤酵母 外源蛋白 转录因子 过表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
许佳惠 尹雅洁 李欣悦 柳凯 梁运祥 赵述淼 胡远亮
将Brevibacillus brevis US575角蛋白酶基因kerUS进行密码子优化,并在毕赤酵母GS115中表达,以提高角蛋白酶产量。结果表明:优化的基因可在毕赤酵母中成功表达,重组角蛋白酶的分子质量约30 ku,最佳反应条件为pH 9.5和60℃,1 mmol/L的Mn~(2+)、Ba~(2+)对角蛋白酶活性有促进作用。此外,重组角蛋白酶易降解干酪素和β角蛋白(羽毛粉),酶促反应最大速度v_(max)=0.019 g/(L·min),K_m=4.64 g/L,比活力=440 U/mg。研究获得的产角蛋白酶重组毕赤酵母具有较好的应用前景。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄镇太 杨金玲 程克棣 朱平
凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)是氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的主要受体,它与动脉粥样硬化过程密切相关。通过RT-PCR从THP-1细胞系获得LOX-1 cDNA并被克隆到载体pPIC9K的a信号肽的下游。线性化的重组质粒转化Pichia pastoris GS115。阳性转化子经过BMMC液体培养基培养,上清液经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,出现1条在受体菌对照中不曾有的大小约43 kDa的蛋白带。重组蛋白的功能研究在进行中。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
苏岚 曾令兵 周勇 张辉 高正勇 张金凤
根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐学清 曹瑞兵 蔡梅红 任雪枫 周斌 陈溥言
对含猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因插入的重组酵母菌株进行诱导表达,通过对诱导时间、重组酵母菌株、菌体密度、培养液pH、甲醇剂量等培养条件与表达产量关系的分析,对重组蛋白的表达条件进行了优化。优化后的条件为:28～30℃,225r/min振荡培养至BMGY中菌体OD600值为3.0～3.5时,将菌体转入相当于4倍体积BMGY,pH为6.0的BMMY培养基中培养72h,每24h加入甲醇至终浓度为总体积的0.5%～1.0%。在此优化条件下,重组蛋白的表达量可达275.38μg/mL,比较温度对重组蛋白降解率的影响后发现,培养物上清液应保存于-20℃。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王树云 李江宇 高志强 谷强 蒲静 任彤 张伟 张旻 江育林 武勇 张利峰
根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。
关键词：
鲤春病毒血症病毒 糖蛋白 毕赤酵母
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
耿小雪 王小霞 周怡 徐玮 张文兵 麦康森
近年来，重组ＶＰ２８和ＶＰ２６蛋白作为蛋白亚单位疫苗，在增强对虾抗白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）感染的过程中具有重要作用。本研究根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中ＷＳＳＶ的基因序列设计引物，以ＷＳＳＶ粗提液为模板进行普通ＰＣＲ扩增，得到ＶＰ２８和ＶＰ２６基因，再用引物悬挂法将ｅＣｏ ＲⅠ和ＸＢａⅠ酶切位点分别添加到ＶＰ２８和ＶＰ２６基因的５端和３端。目的基因经双酶切后插入到表达载体Ｐ ＧａＰＺαａ，转化ＴｏＰ１０大肠杆菌，经博莱霉素（ＺｅｏＣｉｎ）抗性筛选阳性重组酵母表达载体。ａＶＲⅡ酶切线性化之后，电击转化Ｘ－３３毕赤酵母感受态细胞，经ＺｅｏＣｉｎ抗性筛选得到阳性重组酵母。ＳＤＳ－ＰａＧｅ电泳分析重组酵母表．．．
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
刘庆慧 陈婷 黄倢
研究发酵时间和接种量对WSSV-VAP1重组菌蛋白表达量的影响及重组毕赤酵母中外源基因的稳定性。结果表明,构建的重组菌SMD1168/pGAPZaA-VAP1在发酵72h后,蛋白表达量占总蛋白10.45%,控制接种量对基因工程菌Pichia pastoris表达WSSV-VAP1非常重要。外源基因的插入对宿主菌的生长未产生明显的影响,重组质粒在毕赤酵母SMD1168中很稳定。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王川 盛鸥 窦同心 李斌 胡春华 杨乔松 邓贵明 董涛 李春雨 易干军 毕方铖
[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白，深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白，通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况；利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况；利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作；最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×10~6和3.2×10~6 CFU·mL~(-1),平均插入片段大小在1 200 bp以上，可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白，其中有2个MADS-box转录因子，3个E3泛素连接酶，2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明，乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达，而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明，MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示，MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低，这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术，鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白，并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04＿p30020.1之间存在明显的互作关系。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨玉霞 张慧玲 汪艳 陈勇
为实现瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLU)的高效表达,开发新的饲用β-葡聚糖酶资源,根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、G+C含量等特点,对FsGLU基因进行密码子优化,然后合成优化后的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLUm),转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达并对重组FsGLUm的酶学特性、底物特异性和对消化酶的耐受性进行了研究。结果表明:摇瓶水平条件下,以甲醇诱导表达48 h时,重组FsGLUm酶活性提高25.1%(P
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
罗倩 黎继烈 王卫 郭璐 朱晓媛
对重组毕赤酵母发酵产青霉素G酰化酶(PGA)的培养条件进行探讨。依据基础盐摇瓶发酵培养基,通过单因素试验考察了接种量、甘油浓度、pH以及诱导过程中氨水浓度、甲醇浓度等因素对PGA表达的影响。并采用Box-Behnken实验设计进行因素组合优化。结果与意义:最佳发酵条件为:甘油浓度40 g/L、氨水浓度0.1%、甲醇浓度1.0%、pH 5.6、接种量10%,在此条件下PGA酶活力达到8 680±12 U/L。本实验结果对下一步利用发酵罐进行重组毕赤酵母扩大培养有借鉴作用。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
袁枫 宋慧琦 侯磊 韦莉 朱珊珊 全荣 王菁 王丹 姜海军 刘浩 刘爵
为研制禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)亚单位疫苗,本研究对FAdV-4的Fiber-2蛋白在毕赤酵母中的发酵工艺进行了优化。首先根据酵母密码子偏好性优化Fiber-2基因,并且构建了重组真核表达载体pPIC9K-Fiber-2。将该质粒转化至毕赤酵母GS115菌株,经不同质量浓度G418筛选获得高拷贝重组菌。随后在摇瓶中进行诱导发酵时温度、时间和甲醇浓度的优化。用优化后的条件进行发酵表达并将上清液通过镍柱纯化得到了重组的Fiber-2蛋白。最后将蛋白与ISA-201-VG油佐剂混合并免疫21日龄SPF鸡进行免疫保护性试验。结果表明:在毕赤酵母中成功且高效的分泌表达了Fiber-2蛋白,分子量约为60ku,在摇瓶发酵中诱导的最佳甲醇浓度、时间和温度分别为1.0%、72h和30℃。优化后发酵液上清中的总蛋白量约为50mg/L,重组Fiber-2蛋白达到8.7mg/L。SDS-PAGE和Western blot结果表明采用镍柱对蛋白进行纯化可得到条带单一且具有良好免疫原性的重组Fiber-2蛋白。免疫保护性试验显示,由优化后的毕赤酵母表达Fiber-2蛋白制备的亚单位疫苗免疫雏鸡后,可以诱导较高的抗体水平并提供高达100%的超强FAdV-4毒株(GD616)的攻击保护。本研究为进一步采用毕赤酵母表达的重组Fiber-2蛋白制备FAdV-4亚单位疫苗的研发奠定了基础。
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
付峰 刘荭 范万红 江育林 黄倢
根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
吴成龙 史成银 黄倢 孔晓瑜
依据大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot viral reddish body iridovirus,TRBIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因序列,设计了一对特异性引物,并在正反向引物中分别引入EcoR I和Not I酶切位点,从而将PCR扩增得到的TRBIV MCP基因双酶切后定向克隆到真核表达载体pGAPZαA的GAP启动子的下游位点,并电转化入大肠杆菌DH5α宿主菌内。经抗生素Zeocin筛选、PCR、EcoR I和Not I双酶切以及测序分析,构建了含有α-factor信号肽的真核重组表达载体pGAPZαA MCP。重组表达质粒pGAPZαA MC...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
何超军 邱杨玉 毛芝娟 陈吉刚 吴志新
采用已构建的原核重组质粒pET30a-OmpK为模板,通过PCR扩增OmpK成熟肽基因片段,引入酶切位点后克隆至分泌表达载体pPIC9K,经SalⅠ线性化后,氯化锂法转化至毕赤酵母GS115中,并经G418遗传霉素筛选高拷贝酵母转化子,最后进行甲醇诱导表达,表达上清经SDS-PAGE电泳检测及Western-blot鉴定,表明重组蛋白已经表达。
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