根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。

应用转基因玉米NK603品系特异实时定量PCR方法,测定含量为2%的转基因玉米NK603样品中旁侧片段(品系特异片段)的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定了测量的不确定度。结果表明,u A=0.0008,u B=0.001,u C=0.001,U=0.002,测量结果为1.9%±0.002。NK603品系特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。

根据转基因玉米NK603载体构建特异序列,设计引物和Taqman探针,建立了转基因玉米NK603载体构建特异结构定量PCR检测方法,并采用该法检测了2%含量的NK603标准品(不确定度为10%)。结果显示,采用本文构建的方法获得的标准曲线斜率,在-3.6～-3.1之间,相关系数大于0.99,扩增效率为98.1%,在90%～110%的范围内。样品检测结果(1.6%)接近已知含量(2%,不确定度为10%)。表明本文建立的转基因玉米NK603结构特异定量PCR检测方法,可以在日常检验中推广应用。

应用四川省农业科学院分析测试中心实验室建立的转基因玉米NK603结构特异实时定量PCR方法测定含量为2%的转基因玉米NK603样品中结构特异片段的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定了测量的不确定度。结果表明,uA=0.0003,uB=0.001,uC=0.001,U95=0.002,测量结果为1.6%±0.002%。NK603结构特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。

【目的】批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象。转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法,建立转基因玉米NK603的数字PCR(dPCR)方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术。【方法】采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603;将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合,遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法;设置二重微滴数字PCR(ddPCR)的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度,优化二重ddPCR的反应体系和反应条件;用梯度稀释的标准质粒溶液作模板,考察二重ddPCR的检测极限、定量极限和动力学范围;将转基因玉米NK603种子粉末和非转基因玉米种子粉末混合,配制质量分数分别为100%、10%和6%的盲样,考察二重ddPCR的定量准确性。【结果】用标准质粒分子pUC57-NK603作为二重ddPCR的质控对照,通过考察二重ddPCR反应热图的微滴信号强度、阳性微滴与阴性微滴分辨率、雨滴数量、NK603转化体与内标基因拷贝数比值测量值与预期值的一致性,确定将NK603转化体特异性PCR方法与内标基因zSSIIb PCR方法组合,建立NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。二重ddPCR反应体系中NK603转化体和zSSIIb内标基因的引物/探针浓度相同,均为400 nmol·L-1/200nmol·L-1,在60℃退火延伸。NK603/zSSIIb二重ddPCR的检测极限是2 copies DNA模板,定量极限是48 copies DNA模板,动力学范围是10—60 000 copies DNA。应用NK603/zSSIIb二重ddPCR方法可准确定量玉米盲样中的NK603转化体含量,定值结果变异系数小于25%;dPCR定量结果与荧光定量PCR(qPCR)定量结果无显著差异,且具有更高的精确性。【结论】内标基因的选择会影响dPCR定量结果的准确性,在建立dPCR方法的过程中,要用具有准确量值的样品作为质控对照,评估内标准基因的适用性。以人工合成的标准质粒分子pUC57-NK603为质控对照,建立了NK603/zSSIIb二重ddPCR方法。应用建立的二重ddPCR定值方法进行标准物质的研制和定值,已成功研制出转基因玉米NK603有证标准物质。

以转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11为研究材料,建立Bt11环状等温扩增快速检测技术方法。利用一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶,针对Bt11中玉米基因组与外源基因结合处序列,设计4条特异引物,并对反应温度、时间、灵敏度、结果判断方法等参数进行初步探索。结果显示,LAMP检测方法最适反应温度及反应时间分别为65℃和60min,其灵敏度为常规定性PCR的20倍。LAMP技术检测转基因玉米品系Bt11具有特异性高、快速、简便等优点,具有广阔的应用前景。

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。

以棉花内源基因sad1、报告基因GUS、外源抗虫基因Cry1 Ab/Ac、筛选基因NPTⅡ、NOS终止子和CaMV35 S启动子为检测对象,设计的6对引物能扩增长度合适的基因片段且避免了引物二聚体。通过优化PCR扩增体系中不同引物终浓度的配比以及退火温度对多重PCR检测的影响,建立了棉花转基因成分6重PCR检测体系。结果表明:采用本研究建立的棉籽基因组DNA提取方法,该6重PCR检测体系能够有效地从少至1颗棉籽的少量样品里检测出棉花中的转基因成分。

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。

采用改进的CTAB法,研究了与PCR相匹配的转基因小麦单株微量DNA的快速提取方法。结果表明,该提取方法简便、快速、有效,提取的DNA产量和质量完全可以用于PCR扩增。对标准PCR的反应体系进行优化,建立了最佳的转外源高赖氨酸基因小麦植株的PCR扩增体系,即10×R eaction Bu ffer 2.5μL,M gC l225 mm o l/L,dNTP s 2.5 mm o l/L,模板DNA 30~60 ng,引物1.2μm o l/L,T aq酶1 U,加ddH2O至25μL,优化的PCR反应体系显著提高了转基因小麦植株筛选和鉴定的效率。

【目的】玉米孢囊线虫（Heterodera zeae）为孢囊线虫属定居型半内寄生线虫，可侵染多种禾本科作物的根部，玉米孢囊线虫的发生和传播扩散将会对我国玉米生产造成严重威胁。本研究旨在建立玉米孢囊线虫的快速分子检测体系，以期从近缘属种可以准确地检测出玉米孢囊线虫，为玉米孢囊线虫的监测预警和防控打下技术基础。【方法】从我国河南、河北、甘肃、山东、湖南、广西和北京共收集20个玉米孢囊线虫近缘属种群体作为供试线虫；选取13条含有10个碱基的随机引物，采用RPAD技术对供试孢囊线虫进行多态性分析，筛出玉米孢囊线虫特异性RPAD片段，并将其转化为玉米孢囊线虫SCAR-PCR引物；采用PCR方法测试玉米孢囊线虫特异性引物的准确性以及检测技术体系的稳定性、灵敏度和实效性。【结果】通过RAPD比对分析，发现随机引物OPA03能在玉米孢囊线虫基因组DNA中扩增出一条468 bp的特异性片段；将该片段回收测序，根据片段序列信息，利用Primer 5.0设计一对特异性引物HzF1/HzR1；特异性检测结果表明，HzF1/HzR1仅在玉米孢囊线虫群体中扩增出大小为393 bp的特异性片段，其他5种16个孢囊群体（禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫）和4个其他种群（水稻干尖线虫、马铃薯腐烂茎线虫、落选短体线虫和咖啡短体线虫）均没有扩增出目的条带；以含有玉米孢囊线虫的混合种群孢囊DNA为模板时，特异性引物HzF1/HzR1也能扩增出来单一明亮的393 bp的特异片段，而不含玉米孢囊线虫的混合种群不能扩增出该片段；该体系实现了玉米孢囊线虫准确、稳定的检测目的；对建立的玉米孢囊线虫快速检测技术体系灵敏度和实用范围测试，表明该检测体系对玉米孢囊线虫单个孢囊和单条幼虫均有灵敏的检测能力，检出值不低于1/2 000个孢囊和1/80条2龄幼虫。【结论】本研究建立的玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术，可用于玉米孢囊线虫单一样本和混合种群的快速检测，对玉米孢囊线虫的孢囊和2龄幼虫均有灵敏的检测能力，检测引物特异性强，检测方法便捷稳定，灵敏度高。

根据转基因玉米MON863载体构建特异结构,设计引物和Taqman探针,建立了转基因玉米MON863载体构建特异结构定量PCR检测方法,并采用该法定量检测了1%含量的MON863标准品(不确定度为10%)。结果显示,采用本文构建的方法获得标准曲线斜率,在-3.6～-3.1之间,相关系数大于0.99,扩增效率为105.436%,在90%～110%的范围内。待检样品的定量检测结果(1.08%)非常接近真实值(1%,不确定度为10%),表明本文建立的转基因玉米MON863结构特异定量PCR检测重复性好,灵敏度和准确度高,可以在日常检验中推广应用。

本试验针对已商品化的转基因大豆、玉米和水稻的主要外源基因Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因和PAT基因及共有的内标准基因RBCL基因设计了10对引物,对从超市购买的进口大豆、玉米和水稻的11种深加工制品(未标注是否含有转基因成分)进行了五重巢式PCR定性检测。第1轮普通五重PCR检测,11个待测样品均未出现任何转基因成分,其灵敏度为0.5%;第2轮将普通五重PCR扩增产物进行五重巢式PCR检测,结果在卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品和婴儿米粉中扩增出RBCL基因,玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和PAT基因;玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、Cry1...

为明确牙鲆及大菱鲆病原迟钝爱德华菌毒力基因的携带情况并建立分子检测方法,实验以迟钝爱德华菌fimA、fimB、gadB及citC为靶基因设计特异性引物,进行PCR扩增及环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并对其特异性、灵敏性和实际应用进行了比较。结果显示,10株病原迟钝爱德华菌均扩增出fimA、fimB、gadB及citC 4种毒力基因,目的条带大小分别为240、217、171及119 bp,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA和gadB设计的两对引物进行的双重PCR扩增,同一PCR反应体系中病原迟钝爱德华菌可扩增出240和...

麦根腐平脐蠕孢是玉米根腐病的重要病原菌之一，旨为建立一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的麦根腐平脐蠕孢快速检测方法。首先，根据麦根腐平脐蠕孢参与黑色素生物合成途径的Brn1基因部分序列设计了一套LAMP检测引物；然后，针对该引物组筛选了其最佳反应温度，检测了LAMP反应的特异性和灵敏度，并以人工接种麦根腐平脐蠕孢的玉米根腐病病株为样本评价了LAMP检测方法的效果。结果表明，本研究设计的引物组在61～68℃条件下均能实现对靶标基因的扩增，其中以66℃为最佳反应温度；在特异性检测中，引物组能从10种分离自玉米根腐病样本的主要病原真菌DNA中特异性地检测出麦根腐平脐蠕孢；在灵敏度检测中，对携带靶基因Brn1的质粒DNA最低检测限是10 copies/μL,在此检测限浓度下，25 min左右即可实现扩增；在对玉米根腐病样本检测中，在1 pg/μL的玉米根组织DNA中即可检测出麦根腐平脐蠕孢。建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法具有较强的特异性和较高的灵敏度。