【目的】制备抗CAS9蛋白质的单克隆抗体,建立转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测方法,了解CAS9蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以带Cas9的质粒DNA为模板,PCR扩增Cas9 5′端810 bp片段后克隆到p ET30a载体中,将酶切验证且序列正确的重组质粒转入表达菌Condon Plus中,经IPTG诱导表达CAS9蛋白质(N端270氨基酸),用纯化的重组蛋白质作为免疫原免疫小鼠,制备单克隆抗体,用免疫印迹分析筛选特异性和灵敏度高的抗体细胞株。用特异性引物PCR扩增转基因水稻的Cas

为了研究3个不同蛋白质水平(10%、18%、26%)饲粮对肥育猪的钙蛋白抑制蛋白酶(CAST)的影响,对CAST蛋白提取、电泳、转膜等条件进行优化。试验表明:CAST被激活的条件是将蛋白提取液于上样缓冲液95℃煮15min后,立即在冰块上冷却,防止蛋白降解;采用分离胶浓度为10%进行电泳,可以明显检测到68kD、107 kD的CAST;采用预染Marker和DAB染色液可针对性地检测到目的蛋白的位置;利用上述程序检测到了猪CAST两种类型的表达,取得了较满意的结果。

【目的】建立转基因水稻中GUS蛋白质的免疫学检测方法,并了解花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以细菌基因组DNA为模板,PCR扩增GUS基因后克隆到表达载体pET30a中,测序验证的重组子转入大肠杆菌表达菌BL21中,IPTG诱导获得重组表达的GUS蛋白质,用HIS-tag beads纯化后作为免疫原免疫小鼠制备GUS蛋白质特异的抗体,通过免疫印迹分析筛选高特异性的单克隆抗体,用Broadford法对重组的GUS蛋白质进行定量,对不同浓度的GUS蛋白质进行免疫印迹分析,绘制检测GUS蛋白质的标准曲线,通过与标准曲线的比较对水稻叶片中GUS...

本文以抗除草剂(EPSPS)转基因大豆GTS-40-3-2为材料,在Lectin基因的扩增体系中设置了不同浓度的十二烷基硫代硫酸钠(SDS)和酚,探讨了SDS和酚这两种蛋白质变性剂在转基因成分检测中的抑制作用。结果表明,在反应体系中SDS的浓度大于或等于4.8×10-4g/mL时,能完全抑制PCR反应;酚的体积比大于或等于8.0×10-3时,体系中的DNA聚合酶全部变性,PCR反应彻底被抑制。

【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。

比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。

在优化水稻叶片蛋白质提取方法的基础上,利用免疫沉淀对水稻中的XA21蛋白质进行了富集纯化,继而通过TCA-丙酮法脱盐,用尿素、硫脲溶解后进行双向电泳分离和Western检测,实现了对高分子量、低丰度表达的、可能的膜蛋白XA21的分离检测,为其翻译后修饰方式研究奠定了基础。

利用Western印迹法对胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-1,IGF-Ⅰ)及其受体(IGF-Ⅰreceptor,IGF-ⅠR)蛋白在牙鲆仔鱼发育变态阶段的表达进行分析。结果显示IGF-Ⅰ蛋白在仔鱼变态前(17 d)和变态起始阶段(21 d)免疫活性较强,而在变态期间降低;IGF-ⅠR蛋白在变态起始阶段的表达与IGF-Ⅰ类似,但在变态期间与IGF-Ⅰ相反,具有相对丰富的表达。这些结果为进一步研究IGF-Ⅰ及其受体在牙鲆变态中的生理意义奠定了基础。

为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。

在从患病大口鲇中分离到普通变形杆菌TWN-3株的基础上,将该菌总DNA用EcoRI不完全酶切后,分离5kb左右的片段,连接入pUC18质粒,转化E.coli BL21,构建基因组文库,得到3.6×103个重组子,远大于理论计算的1831个重组子,随机挑选重组子经EcoRI酶切鉴定重组率为100%,文库构建成功;将该菌裂解液与佐剂混合,免疫雄性新西兰大白兔,免疫程序结束后,抽血并分离血清,对用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后的文库进行免疫印迹筛选,最终得到8个阳性克隆子。本实验为该菌的DNA疫苗以及重要基因表达研究打下基础。

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T_0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T_1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T_2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g~(-1),极显著(P<0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g~(-1))。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。

【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段——CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLg RNA-U3、pYLg RNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-g RNA、U6a-qSH1T1-g RNA表达盒,最后将2个g RNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T0代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T0代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T0代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T1代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T1代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T2代qsh1纯合突变系群体(17SZ01和17SZ02)。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。

目的研究利用近红外光谱分析法定量分析水稻完整籽粒粗蛋白含量的可行性,初步探讨水稻杂种后代蛋白质含量的分离和变异,以期为水稻的营养品质育种提供参考依据,提高育种效率。方法收集蛋白质含量变幅(5.90%～14.50%)较大的191份代表性水稻样品,采用偏最小二乘(PLS)法建立糙米粗蛋白预测的校正模型。结果通过比较光谱预处理方法在不同谱区的处理效果:采用一阶导数+矢量标准化预处理、谱区为11998.9cm-1～5449.8cm-1和4601.3cm-1～4246.5cm-1建立校正模型的检验和预测效果最佳,糙米蛋白质的近红外测定值和化学测定值之间有较高的相关性和较低的误差;其决定系数为0.9886...

为了探讨高产四倍体水稻的不同遗传组成与品质的关系,以及蛋白质含量变化的原因,以国家优质品种美香占2号(MXZ2)、象牙香占(XYXZ)、矮脚南特二倍体(AJNT-2x)、高产同源四倍体水稻矮脚南特(AJNT-4x)以及高产新型四倍体水稻华多1号(H1)为试验材料,利用BCA法测定胚乳蛋白质含量、近红外谷物分析仪进行品质分析、全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量、qRT-PCR分析谷蛋白基因的表达差异。结果表明:AJNT-4x糙米、精米的蛋白含量分别为182.70,115.70 mg/g,高于国家优质品种MXZ2、XYXZ以及AJNT-2x,其营养品质大大提高;AJNT-4x的胶稠度为44.70 mm,低于MXZ2、XYXZ及AJNT-2x,且差异显著,其食用品质明显下降;而H1精米的蛋白含量最低,只有71.30 mg/g,但其胶稠度为112.70 mm,介于国家优质品种MXZ2与XYXZ之间。花后30 d AJNT-4x的17种氨基酸总量与人体必需氨基酸总量高于AJNT-2x与H1,H1的最低;H1的17种氨基酸总含量在花后15 d达到高峰,而AJNT-4x和AJNT-2x在花后20 d达到高峰,氨基酸含量积累过早停止导致H1在成熟期的总氨基酸含量下降,甚至低于AJNT-2x。在整个胚乳发育过程中,AJNT-4x、H1和AJNT-2x的4种贮藏蛋白积累趋势基本一致,但快速积累时间存在差异;AJNT-4x的谷蛋白快速积累的时间比AJNT-2x、H1早,且快速积累的时间长,导致AJNT-4x的蛋白含量最高。9个谷蛋白亚家族基因在花后5 d都有表达,随着胚乳的发育,各谷蛋白基因表达量逐渐升高、再逐渐下降并趋于稳定,不同的亚家族谷蛋白基因在相同的时间表达丰度不同;除GluB-1和GluB-4在H1中的表达峰值高于AJNT-4x和AJNT-2x,其他7个谷蛋白基因在H1中的表达峰值均远远低于AJNT-4x和AJNT-2x,差异显著;AJNT-4x的9个谷蛋白基因在花后30 d表达量均最高。上述结果为多倍体水稻优质育种提供理论依据。

采用水培试验研究了正常氮和低氮水平下两个早稻常规品种氮素营养特性的差异 .结果表明 :高蛋白基因型湘早籼 2 4号在两种氮水平下其根系活性吸收面积 ,α-萘胺氧化力 ,叶、茎鞘、籽粒的全氮、蛋白氮含量与功能叶的硝酸还原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性明显高于低蛋白基因型中优早 81号 .合理增施氮肥有利于提高根系吸收能力、氮素的吸收和同化能力及籽粒蛋白质含量