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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
敖金霞 高学军 曲波 袁肖寒 刘营 仇有文 郭士成
将转基因大豆、玉米和水稻的主要外源Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因和内参RBCL基因目标片段分别克隆到克隆载体pMD18-T中,构建获得的质粒可作为定性检测3种转基因粮食作物的上述外源基因的通用标准分子质粒pMD18-T-PAT-CP4-EPSPS-Cry1 A(B)-BAR-RBCL,长约4.7 kb。经过双酶切、测序及PCR扩增,获得与预期片断大小及序列一致的目的基因片段,证明所构建的标准分子质粒是正确的,可以用来作为不同品种转基因粮食作物定性检测CP4-EPSPS基因、Cry1 A(B)基因、BAR基因和PAT基因的通用阳性标准分子。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
仇有文 张明辉 于艳波 甄贞 王傲雪 高学军
以A2704-12、A5547-127、MON89788和GTS-40-3-2等4种商品化耐除草剂转基因大豆为材料,构建质粒标准分子用于解决转基因作物检测时标准物质缺乏现状。采用双酶切技术,将扩增的大豆内参基因和耐除草剂转基因大豆转化体特异性片段克隆至pMD18-T载体上。结果显示,质粒标准分子定性PCR特异性序列片段的LOD均为20copies/μL,定量检测体系Bias最大值≤9.89%,CV最大值≤5.96%,SD最大值≤0.06,实验得到的所有偏差值均在允许范围之内,构建的质粒标准分子适用于4种耐除草剂转基因大豆特异性检测。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
敖金霞 高学军 于艳波 曲波 李庆章
本试验针对已商品化的转基因大豆、玉米和水稻的主要外源基因Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因和PAT基因及共有的内标准基因RBCL基因设计了10对引物,对从超市购买的进口大豆、玉米和水稻的11种深加工制品(未标注是否含有转基因成分)进行了五重巢式PCR定性检测。第1轮普通五重PCR检测,11个待测样品均未出现任何转基因成分,其灵敏度为0.5%;第2轮将普通五重PCR扩增产物进行五重巢式PCR检测,结果在卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品和婴儿米粉中扩增出RBCL基因,玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和PAT基因;玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、Cry1...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杜建中 孙毅 郝曜山 刘俊玲
采用花粉介导方法将质粒pGL II_RC_1导入玉米自交系海92_1中,获得了T0种子128粒,种子经潮霉素抗性筛选得到抗潮霉素植株16株。对抗性植株分离的统计分析表明,多数情况下几丁质酶基因以单拷贝形式导入转基因植株,后代分离比约为3∶1。抗性苗移栽到大田后,5~6叶期取样进行PCR扩增、PCR Southern blot杂交分析,对T1的分析结果表明,几丁质酶基因已导入转基因植物细胞中。对T2,T3植株的检测结果显示,目的基因已整合到转化植株基因组中并可随植株世代稳定遗传。田间抗病鉴定结果表明,转基因植株及后代的玉米丝黑穗病发病率明显比对照降低。根据分子检测及田间抗病鉴定结果,得到GH05...
[期刊] 华北农学报
[作者]
兰青阔 王永 赵新 朱珠 景海春 程奕
以转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11为研究材料,建立Bt11环状等温扩增快速检测技术方法。利用一种具有链置换活性的BstDNA聚合酶,针对Bt11中玉米基因组与外源基因结合处序列,设计4条特异引物,并对反应温度、时间、灵敏度、结果判断方法等参数进行初步探索。结果显示,LAMP检测方法最适反应温度及反应时间分别为65℃和60min,其灵敏度为常规定性PCR的20倍。LAMP技术检测转基因玉米品系Bt11具有特异性高、快速、简便等优点,具有广阔的应用前景。
关键词：
转基因玉米 环状等温扩增 检测
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
魏嘉 王秀东 卜显峰 马瑞 于志晶 蔡勤安
[目的]转基因大豆事件L8014是本研究前期利用农杆菌介导的大豆子叶节高效遗传转化技术体系，将来源于山菠菜的基因BADH导入大豆(Glycine max)‘Williams 82’而获得具有良好耐盐(1.5%NaCl)性状的转基因大豆(该材料已经完成环境释放试验)。T-DNA插入位点侧翼序列的获得与分析对于转基因事件的安全评价及应用非常重要，本文旨在明确该转基因大豆材料的分子特征及其检测方法，以进一步推进安全评价。[方法]利用Southern杂交检测转基因大豆外源基因的拷贝数；基于基因组重测序技术，采用BWA(Burrows-Wheeler-Alignment)方法将重测序数据与T-DNA序列以及大豆基因组序列进行比对分析。[结果]T-DNA在大豆基因组10号染色体上的基因组区间3925017—3926022位点，插入方式为反向插入；结合PCR扩增技术获得外源T-DNA整合位点的左、右边界侧翼序列，基于该序列建立了转BADH基因大豆事件L8014的特异性PCR检测方法。[结论]本研究获得了转基因事件的整合位点及侧翼序列，方法快速、结果可靠，为转基因大豆及其衍生产品的检测提供了技术支撑。
[期刊] 华北农学报
[作者]
姚梦瑶 李娟 刘志刚 蔡大润 李晓荣 李波 杨洋 王子轩 王勇攀 陈勋基 耿洪伟 陈果
盐碱胁迫已成为制约我国农业生产的重要因素之一，探索农作物耐盐分子机理，对作物育种具有重要的理论价值和实际应用价值。旨在克隆玉米中的ZmMPI基因，转化玉米植株。首先通过qRT-PCR对盐碱溶液处理下植株中的ZmMPI表达量变化进行分析，之后利用DNAMAN软件对ZmMPI蛋白序列进行多重比较分析同时利用MEGA 7.0软件构建系统发生树，并利用一系列软件对ZmMPI进行生物信息学分析。最后利用分子克隆技术，成功克隆ZmMPI基因的编码序列，构建植物过表达载体并利用农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米自交系B104,在基因组水平、转录水平以及蛋白质水平对过表达转基因植株鉴定，分析其表达量变化。结果表明，ZmMPI基因的表达量受盐碱胁迫后整体呈现出先上升后下调的趋势；ZmMPI蛋白序列比较结果相似率为64.15%,系统发生树显示，ZmMPI与玉米(小颖大刍草亚种) ABA34115.1同源性最高，该蛋白含有一个蛋白结构域Potato＿inhibit,有α螺旋结构、无规则卷曲结构和β转角结构，偏疏水性，预测潜在的磷酸化位点有10个；对获得的49个转化事件鉴定结果显示，其中有13个过表达转基因株系中的ZmMPI基因在基因组水平能正常表达，有10个过表达转基因株系中的ZmMPI基因能正常转录、翻译。最终获得10个能够正常转录翻译的过表达转基因株系，为进一步探究ZmMPI基因响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
刘双 赵新 李瑞环 刘娜 兰青阔 檀建新 王永
为实现转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’转化体成分的精准定量检测,以转基因大豆‘ZH 10-6’的5′端边界序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针浓度进行优化,经特异性测试,建立了耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’的微滴式数字PCR检测方法。结果表明:1)特异性良好:只有以转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’基因组为模板才有扩增信号;2)灵敏度高:在相对标准偏差≤25%的情况下,方法的检出限(LOD)为13.0个拷贝;定量限(LOQ)为66.0个拷贝;3)PCR扩增反应模板含量与样品拷贝数之间线性相关系数R2>0.99,DNA含量线性范围为0.08%～100.00%。综上,本研究建立的转基因耐除草剂大豆‘ZH 10-6’转化体定量方法特异性强、稳定性好、准确度和灵敏度高,可用于对转基因大豆品种‘ZH 10-6’的定量检测。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
甄贞 张明辉 刘营 敖金霞 于艳波 李璐 曲波 仇有文 高学军 张克俭
根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
朱元招 尹靖东 李德发 王凤来
试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNASYBRGreenI结合染料实时荧光定量PCR技术,扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因,绘制2种基因扩增的循环数拷贝数标准曲线图,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量;并作重现性和熔解曲线分析。结果表明,lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好,R2值分别达到0.9997和0.9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示,实测值与实际值接近,相对偏差5%～11%。SYBRGreenI实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。
[期刊] 华北农学报
[作者]
金红 程奕 赵昕 王永
针对大豆色拉油中DNA较难提取的问题提出了充分乳化、延长醇沉淀时间和反复富集小片段DNA等措施,有效地从大豆色拉油中提取到DNA,并通过大豆特异内源基因扩增得以证明。从两个不同品种商品大豆色拉油中检测出35S启动子和NOS终止子外源调控序列,并通过增加所用DNA模板用量检测出目的基因EPSPS序列,建立了大豆色拉油中转基因成分检测方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王超 李霞
为了阐明转玉米PEPC基因水稻高光效的结构基础,以转玉米PEPC基因水稻和未转基因原种为试验材料,在水稻的三叶期,施以100 min,1 000μmol/(m2.s)的高光强处理,以200μmol/(m2.s)下的水稻为对照,运用透射电镜观察叶肉细胞、维管束鞘以及叶绿体内类囊体片层结构。结果发现,与对照材料相比,转玉米PEPC基因水稻材料经高光强处理后,叶片叶绿体的排列更加紧密,叶绿体中类囊体片层堆垛整齐,有序片层较厚,排列更加致密,类囊体结构更加完整,而且叶绿体周围的线粒体数量明显增多;而未转基因原种的叶片经高光强处理后,叶绿体内类囊体片层松散,结构混乱,部分甚至解体,表现出受到损伤的迹象,...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
宋君 雷绍荣 刘勇 王东 刘文娟 尹全 张富丽 常丽娟
应用四川省农业科学院分析测试中心实验室建立的转基因玉米NK603结构特异实时定量PCR方法测定含量为2%的转基因玉米NK603样品中结构特异片段的含量,并从扩增反应、数据处理以及微量移液器等不确定度来源,评定了测量的不确定度。结果表明,uA=0.0003,uB=0.001,uC=0.001,U95=0.002,测量结果为1.6%±0.002%。NK603结构特异实时定量PCR方法检测结果的主要不确定度来自检验过程中的随机效应。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘军化 黄成志 蒋静玥 吕直文 刘忠贤 蔡钟亚 雷树凡
【目的】探明9个抗稻瘟病基因Pi1、Pib、Pi2、Pi5、Pi9、Pita、Pigm、Pik、Pik-m在水稻材料中的分布情况，分析不同基因型对稻瘟病的田间抗性水平。【方法】选择万州区甘宁镇、恩施市白果乡和湄潭县兴隆镇3个稻瘟病抗性鉴定基地，通过调查基地内水稻叶瘟和穗颈瘟的田间发病情况，筛选出抗病等级在中抗及以上的材料87份，以白果乡基地为取材点，选取供试材料的剑叶，提取DNA，利用PARMS SNP分型原理，检测9个抗稻瘟病基因在87份水稻材料中的分布情况。【结果】3个试验点的水稻材料叶瘟发病较轻，仅湄潭点有27.59%的材料表现为中感，其余材料均表现为中抗及以上；穗颈瘟发病相对较重，其中湄潭点发病最重，全部为中感及以上，有的甚至丧失抗性，恩施点次之，有21.84%的材料表现为中感，万州点最轻，全部表现为中抗及以上。9个抗稻瘟病基因的分布情况：含有Pi1基因的材料4份；含有Pib基因的材料53份，杂合基因的材料5份；含有Pi2基因的材料47份，杂合基因的材料9份；含有Pi5基因的材料72份，杂合基因的材料5份；Pi9和Pik基因0份；含有Pita基因的材料36份，杂合基因的材料8份；含有Pigm基因的材料14份，杂合基因的材料3份；含有Pik-m基因的材料21份。在所测定的9个抗稻瘟病基因中只有几份水稻材料为单基因分布，多数材料至少有2个聚合基因分布，最多的含有5个聚合基因，还有2份材料中未检测到这些基因。【结论】综合稻瘟病田间抗性鉴定和抗稻瘟病基因检测结果，明确了单一稻瘟病抗性基因和聚合基因的抗性都在减弱，因此，挖掘抗稻瘟病能力强的新基因、新材料是选育抗稻瘟病新品种的有效途径。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
余桂容 张维 杜文平 宋军 陈谦 徐利远
【目的】本研究是从前期获得的100余份转基因抗除草剂草甘膦玉米品系中,挑选T抗-1等14个转基因玉米品系进行拷贝数检测。【方法】采用一种新型的拷贝数分析方法——微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,简称dd PCR),设计特异引物对外源抗草甘膦基因2m G2-epsps进行绝对定量分析。【结果】供试的14份转基因材料中10份是单拷贝品系。同时,通过引物探针特异性试验、叶片基因组DNA的PCR抑制和浓度检测、转基因玉米的外源基因2m G2-epsps的实时PCR检测和基因组DNA的酶切
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