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[期刊] 中国农业科学
[作者]
张茂 张冠冠 刘德武 蔡更元 吴珍芳 李紫聪
【目的】将前期构建的含有黑曲霉β－甘露聚糖酶基因ｍａｎａ的质粒ｐ ｐＳｐＢＧｐ－ｍａｎａ转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞，利用Ｇ４１８筛选出转基因细胞系，通过体细胞核移植方法生产出转ｍａｎａ基因猪，利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测，同时测定转基因猪唾液β－甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量，旨在为生产及进一步研究转ｍａｎａ基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶ｎｏｔ Ｉ将质粒ｐ ｐＳｐＢＧｐ－ｍａｎａ线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞，然后用不同浓度的Ｇ４１８进行筛选、维持培养，将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪；克隆猪出生后采取尾组织样．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张学文 田志坚 吴永尧 周双德 康冬丽
为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物.以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段.经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员.将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRSET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21DE3(pLysS),经过诱导获得了此酶的高效表达.
关键词：
β-甘露聚糖酶 基因克隆 表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张献伟 张冠冠 吴珍芳 孟繁明 刘德武 张茂 许卫华 郑恩琴 贺晓燕 李真 李紫聪
【目的】构建木聚糖酶(XynB)与甘露聚糖酶(ManA)的融合酶基因,使其能在哺乳动物表达系统中表达并分泌兼有木聚糖酶和甘露聚糖酶活性的双功能融合酶。【方法】利用基因融合技术(SOE-PCR),把11条Linker融合到木聚糖酶(XynB)和甘露聚糖酶(ManA)基因间,构建真核表达载体,经转染猪肾细胞(pK15)收集细胞培养液,用DNS法测定其酶活并进行酶学分析。【结果】经表达分析12条不同Linker构建的融合酶与亲本酶酶活,发现用Linker a3、pS3和具有"自我剪切"能力T2A构建的融合酶在木聚糖酶和甘露聚糖酶活性都显著高于两亲本酶。融合酶XynB-a3-ManA的木聚糖酶和甘露聚...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
张婕 赵敏 卢磊 李慧玲
为了筛选高产β--甘露聚糖酶的细菌菌株,利用刚果红染色法从土壤中筛选分离到1株产β--甘露聚糖酶菌株MM5。通过形态观察、生理生化试验及16SrDNA序列分析进行鉴定,确定其为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。菌株MM5产甘露聚糖酶的活力达到1594U/mL,以MM5为出发菌株,通过紫外诱变得到诱变菌株LD24H4,酶活提高到3717U/mL。通过单因素试验和正交试验确定了菌株LD24H4产酶的最佳培养基组分(g/L):魔芋粉20.0,干酪素2.5,NaCl1.0,MgSO40.5,KH2PO40.5,pH7.5。最适产酶培养条件:47℃,装液量90mL(250mL三角瓶),接...
关键词：
β-甘露聚糖酶 筛选 枯草芽孢杆菌 诱变
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李长影 孔雯 王家昕 高剑锋 李晓华
从工厂废液中分离并筛选到了1株产β-甘露聚糖酶的菌株CYS4,其摇瓶培养液的酶活力为11.0U/mL。经形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。酶学性质研究结果表明:该酶的最适反应pH值为7.0,在pH值为5.0~11.0时能保持很好的稳定性,酶活力在80%以上;该酶的最适反应温度为60℃,在温度低于40℃时基本稳定,保温3 h酶活力仍然有70%以上;Na+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+等金属离子对该酶有激活作用,Hg2+对酶活有一定的抑制作用。
关键词：
β-甘露聚糖酶 分离 鉴定 酶学性质
[期刊] 华北农学报
[作者]
白爱枝 闫祖威 唐国敏 梁运章
以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5'调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1611 bp。通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%。在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"b...
关键词：
黑曲霉 木聚糖酶 基因克隆 序列分析
[期刊] 中国农业科学
[作者]
翟国会 阮小蕾 吴丽婷 谭小勇 李华平
【目的】克隆植物中主要的防卫基因β-1,3-葡聚糖酶基因,为该基因功能研究和有效利用提供理论依据。【方法】通过分析芭蕉科植物的β-1,3-葡聚糖酶基因,据其保守区域设计一对简并引物,通过RACE法从野生指天蕉中克隆得到一个β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA——glu。【结果】glu全长为1 114 bp,其推导的氨基酸序列与GenBank中其它来源的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性为54%—71%。其中,与芭蕉科植物Grand Nain的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性最高(71%)。【结论】在芭蕉类作物中克隆了一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因,为进一步研究该基因的功能并应用于作物...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张晓菲 张夏南 王然 张新富 杨绍兰
以成熟的莱阳茌梨果实为试材,应用同源克隆和RACE方法从茌梨果肉中克隆到内切-β-1,4-葡聚糖酶基因的一个同源基因cDNA的全长序列,命名为PbEG,其碱基长度为1 971 bp,PbEG的开放阅读框编码493个氨基酸,相对分子量为54.596 1 kDa,等电点为9.14;PbEG编码的蛋白属于糖基水解酶第9家族,不含有跨膜区域但在N-端含有一段信号肽。其编码氨基酸同源性分析表明,茌梨PbEG基因与蓖麻EG基因同源性较高,达到84%,其次是豌豆和葡萄。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王江英 张宁 司怀军 吴家和
根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物,利用3',5'-RACE技术,从棉花叶片中克隆出GDP-甘露糖-3',5'-异构酶(GDP-mannose-3',5'-epimerase,GME)基因,命名为GhGME。基因全长1 467 bp,开放阅读框1 131 bp,编码376个氨基酸,分子量为42.39 6 kDa,等电点pI=6.291。利用荧光定量Real-time RT-PCR方法对棉花根、茎、叶和3种处理下该基因的表达特性进行分析,结果表明,GhGME在根、茎中高水平表达,在叶中表达量较低。在4℃低温和200 mmol/L NaCl处理下该基因表达上调,然而用100μmol/L ...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
申艳红 陈晓静 卢秉国 何玮毅
采用cDNA末端快速扩增方法,获得了番木瓜果实GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)基因的cDNA全长序列,将其命名为CpGMP,GenBank登录号为FJ489652.然后,根据拼接序列设计开放性阅读框上、下游引物,扩增得到了CpGMP基因的开放性阅读框序列和DNA序列.ORF序列编码361个氨基酸,DNA序列包含4个外显子和3个内含子.序列分析表明,番木瓜GMP与大果黄褥花、桃、番茄、拟南芥、水稻GMP的同源性分别为90.30%、89.47%、88.92%、88.09%、85.87%.半定量RT-PCR分析表明,CpGMP基因随着番木瓜果实的成熟表达量逐渐增加,软化时又逐渐降低.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蒋倩 王枫 侯喜林 马静 李梦瑶 熊爱生
以2个芹菜品种‘津南实芹’和‘美国西芹’为试材,采用RT-PCR技术分别获得6-磷酸甘露糖还原酶(M6PR)cDNA序列。序列分析表明:来源于2个芹菜品种的6-磷酸甘露糖还原酶基因核苷酸序列全长均为930 bp,编码309个氨基酸;预测其蛋白质相对分子质量为35×103,pI值为6.38。空间结构分析显示:M6PR蛋白由11个α-螺旋和13条β-延伸主链组成,中间形成1个疏水穴;催化四分体(Asp、Tyr、Lys和His)分布于疏水穴内部,具有催化活性。进化分析显示:芹菜M6PR与卷柏、小立碗藓、云杉等远古物种的醛-酮还原酶(AKR)相似性较高。实时定量PCR表达分析表明:M6PR基因主要在芹...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李明想 柏素花 张玉刚 祝军 戴洪义
以苹果幼叶为试验材料,通过同源克隆和RT-PCR方法分离出B_LECTIN基因家族中的一个基因,命名为MdMBL。分析结果表明,克隆得到的MdMBL长度为1 181 bp,包括20 bp的5'非编码区、81 bp的3'非编码区和一个长度为1 080 bp编码359个氨基酸的开放阅读框,推测该蛋白质分子量为39.76 kDa,其等电点为8.72。在构建的MBL系统进化树中,MdMBL与葡萄的MBL的关系最近,其次为橹豆的MBL,与苹果的MBL2同源基因进化关系最远。相对荧光定量RT-PCR分析表明,MdMBL具有组织特异性,在茎中表达量最高,在花中表达量最低;低温胁迫促使MdMBL表达量升高,M...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘小玲 王虹 樊启学 兰江风 林蠡
甘露糖受体(MR)隶属凝集素超家族,主要表达于巨噬细胞和未成熟的树突状细胞表面。MR不仅在先天免疫防御中发挥重要作用,还通过参与抗原呈递,激活T淋巴细胞,启动获得性免疫应答过程。本研究采用同源克隆技术获得黄颡鱼甘露糖受体(pf MR)基因,采用荧光定量PCR技术检测MR在正常黄颡鱼体内的分布情况,采用鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞和甘露聚糖封闭MR方法研究黄颡鱼MR在抗细菌感染中的作用。结果显示,pf MR同团头鲂、草鱼、斑马鱼和尼罗罗非鱼的MR聚为一支。pf MR在所检测的12个组织中均有分布,其在肾
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
胡杨 周海燕 董蕾 吴永尧
兼具纤维素酶和半纤维素酶活性的Man23基因(Man23)来自于芽孢杆菌B23,将其连接到质粒pHY-P43上,由强启动子P43来启动Man23的表达,重组质粒pHY-p43-Man23转入蛋白酶缺陷型芽孢杆菌WB600中,表达产物与原体系相比,甘露聚糖酶活力提高了21%,电泳检测得到的蛋白图谱显示目的酶丰度有显著提高,杂蛋白未见大量表达,可见构建的WB600体系适用于Man23基因表达.
关键词：
甘露聚糖酶 基因表达 芽孢杆菌WB600
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