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[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋杨 刘红弟 王海波 张红军 刘凤之
【目的】分离越橘VcNAC072(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子,分析其表达模式并探讨其在调控花青素合成过程中的功能,为进一步研究越橘花青素积累的调控机理提供理论基础。【方法】以‘公爵’越橘(Vaccinium corymbosum ‘Duke’)为试材,克隆VcNAC072。通过农杆菌介导法获得转基因拟南芥,比较转基因和野生型拟南芥花青素积累的差异。利用酵母单杂交和瞬时表达试验,分析VcNAC072对MYB转录因子AtPAP1的转录调控。【结果】克隆获得越橘VcNAC072,该基因CDS为1 032 bp,编码含有343个氨基酸的蛋白质,含有1个保守的NAC结构域。表达分析显示,该基因在不同发育阶段的果实中均可表达,但表达差异明显,在粉色和蓝色果实中表达量较高,在绿色果实中表达量最低。随着VcNAC072表达的升高,果实中花青素含量呈递增的趋势。分析AtPAP1启动子序列,发现其序列中包含NAC转录因子的结合位点。酵母单杂交和烟草瞬时表达试验结果表明,VcNAC072可与AtPAP1的启动子相互作用,并激活其表达。在野生型拟南芥中异位表达VcNAC072,其种子中花青素积累量显著高于野生型。【结论】推测VcNAC072在越橘果实中正向调节花青素的积累。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐献斌 耿晓月 李慧 孙丽娟 郑焕 陶建敏
【目的】分析参与调控ABA促进葡萄着色的相关基因,探讨ABA促进葡萄果实花青苷积累的分子机制。【方法】以‘红巴拉多’葡萄为试材,在转色前期(约花后6周)使用300 mg·L~(-1) ABA对果穗进行浸果处理,以清水处理为对照。观察表型,并利用超高液相色谱质谱联用仪(UPLC-MS)测定花青苷组分及含量,再利用转录组测序技术从分子水平对ABA促进花青苷积累的机制进行生物信息学分析。【结果】外源ABA处理3 d后,葡萄果实着色明显加深,花青苷种类和含量增多,其中芍药素3-O-葡萄糖苷、锦葵色素3-O-葡萄糖苷两种单体花青苷含量增加最为显著。分析ABA处理18 h和3 d后葡萄果实转录水平的差异,并通过KEGG富集分析发现了11个ABA信号通路基因以及52个与花青苷生物合成和转运相关的基因差异表达,它们均在外源ABA处理后表达上调。通过将差异基因与葡萄转录因子库进行比对,共发现297个转录因子差异表达。进一步分析差异转录因子表达模式,筛选与VvMYBA1表达模式相近的转录因子,发现15个MYB、bHLH、bZIP、NAC、Dof、HD-ZIP等家族的转录因子,其可能参与调控花青苷生物合成。启动子顺式作用元件分析表明,大部分筛选到的差异基因启动子中含有ABRE元件,说明这些差异表达基因的启动子可能为ABA诱导型启动子。对部分候选基因的表达模式进行实时荧光定量(qRT-PCR)分析,证实了RNA-seq的准确性。【结论】ABA促进葡萄花青苷积累涉及11个ABA信号转导、52个花青苷合成和转运相关基因,15个转录因子可能参与调控了这一生物过程。研究结果为揭示ABA促进葡萄花青苷积累的分子机制提供了一定基础。
关键词：
葡萄 花青苷 ABA 转录组 启动子
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
许园园 王燕 柳李旺 徐良 王克磊 张凤娇 聂姗姗 龚义勤
采用电子克隆与基因组步移策略分离出萝卜RsFPF1基因gDNA和cDNA及启动子序列,并进行表达特征分析及转基因功能验证。序列分析表明,RsFPF1基因长度为330 bp,编码109个氨基酸;蛋白同源分析表明,RsFPF1蛋白与拟南芥及白芥FPF1蛋白间亲缘关系最近。RsFPF1基因5'上游启动子区序列长度为1 845 bp,采用PLACE和PlantCARE软件分析表明,该启动子序列含有典型调控元件及多个光响应顺式元件。半定量RT-PCR表达分析表明,开花前RsFPF1基因在茎尖表达量最高,开花后在花及花蕾中表达量最高。通过农杆菌介导的遗传转化获得转RsFPF1基因的烟草阳性植株,与野生型相...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李晓艳 裴嘉博 张志东 吴林 刘海广 李海燕 李亚东
【目的】从越橘果实中克隆花色素合成酶(ANS)基因cDNA,为研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。【方法】以越橘(Vacciniumspp.)品种"北陆"(V.corymbosum L.)为试材,并以Illumina测序文库(NCBI登录号:SRA046311)中差异表达的Unigene 38125片段为基础,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得花色素合成酶基因全长cDNA,利用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和系统进化分析,探讨ANS基因在不同组织和器官中的相对表达量及其与对应花色素苷含量的关系。【结果】成功克隆了越橘花色素合成酶基因序列,命名为VcANS,GenBank...
[期刊] 华北农学报
[作者]
唐维 李强 张允刚 王欣 后猛 刘亚菊 闫会 马代夫
徐紫薯３号具有花青素含量高、萌芽性好、耐储存，综合农艺性状良好等优点。为明确外界因素对该品种的影响，有利于进一步完善栽培措施从而提高该品种的产量以及花青素含量。利用正交试验研究激素（乙烯和赤霉素）、矿质元素（氯化钙和磷酸二氢钾）以及不同栽插期对徐紫薯３号鲜薯产量、薯块花青素含量和薯块花青素产量的影响。结果表明：提早栽插（５月１０日）并施用１．５ ｋｇ／ｈｍ２的赤霉素和３．０ ｋｇ／ｈｍ２的磷酸二氢钾能显著提高徐紫薯３号的鲜薯产量；推迟栽插期（６月１０日）并无需激素和矿质元素处理时，可以提高徐紫薯３号收获时的花青素含量；而提早栽插（５月１０日）并施用１．５ ｋｇ／ｈｍ２的乙烯则能显著提高徐紫薯３．．．
关键词：
激素 矿质元素 紫肉甘薯 花青素
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵佳 刘荣 杨帆 李鑫 刘厚生 严倩 肖月华
【目的】花青素苷是月季花瓣呈红色或粉色的重要因素。R2R3-MYB蛋白是调控植物花青素苷合成的关键转录因子。从月季花瓣中克隆花青素苷调控相关的R2R3-MYB蛋白同源基因,并分析这些基因与月季花瓣颜色和花青素苷合成的关系,为花色基因工程改良奠定基础。【方法】根据植物花青素苷调控相关R2R3-MYB蛋白的保守序列设计简并引物,结合3'-RACE和Y-RACE方法从月季花瓣中扩增同源基因的全长编码序列。用植物第四(Sg4)和第六(Sg6)亚家族的R2R3-MYB蛋白、拟南芥次生代谢调控相关的R2R3-MYB序列和克隆基因的编码蛋白进行多序列比较和进化分析。通过比较不同颜色的月季花瓣中花青素苷含量和...
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋杨 刘红弟 王海波 张红军 刘凤之
为挖掘越橘低温胁迫响应基因在低温逆境胁迫应答中的作用,探讨越橘低温逆境胁迫响应机制,以北陆越橘为试材,克隆低温响应基因VcICE1(Inducer of CBF3 expression 1),分析其表达模式及对低温的响应,探讨VcICE1在抵御低温胁迫中的生物学功能。利用农杆菌介导法获得转基因拟南芥,比较转基因和野生型拟南芥对低温胁迫响应的差异。利用瞬时转化烟草叶片试验,分析VcICE1对AtCBF3的转录调控。结果表明,克隆获得越橘低温响应因子VcICE1,该基因ORF为1 566 bp,编码含有522个氨基酸的蛋白质,含有1个保守的bHLH结构域。系统进化分析表明,VcICE1与AtICE1同源性最高。表达分析显示,VcICE1在根、枝条、幼叶、花和果实中均表达,在幼叶中表达量最高,在果实中最低,并响应低温处理。在拟南芥中异位表达VcICE1,其低温抗性较野生型显著升高。瞬时表达试验结果表明,VcICE1可激活AtCBF3的表达。VcICE1能够对低温处理有明显响应,推测其在响应低温胁迫过程中发挥重要的调控作用。
关键词：
越橘 低温 ICE1 表达分析 功能鉴定
[期刊] 林业科学
[作者]
张芹 徐宗大 赵凯 李晓伟 张罗沙 张启翔
【目的】花青素苷是梅花花色形成的重要色素,R2R3-MYB是花青素苷合成调控的关键转录因子。从梅花中分离出1个R2R3-MYB调控因子PmMYB1,通过分析其序列特征并转入烟草进行功能鉴定,为探明梅花花青素苷合成调控机理及今后梅花花色分子育种奠定基础。【方法】根据梅花基因组数据设计引物,采用RT-PCR方法从梅花花瓣中分离PmMYB1基因,利用DNAMAN软件预测氨基酸序列,通过多序列比对和系统进化树构建分析其保守序列并进行功能预测,通过构建表达载体将PmMYB1基因转入烟草,分析转基因烟草的表型及花青素苷含量的变化,并利用实时荧光定量RT-PCR技术测定该基因及烟草内源花青素苷合成通路基因在转基因植株不同器官中的表达量,综合分析以上数据鉴定PmMYB1基因的功能。【结果】从梅花中分离得到全长为729 bp具有完整编码区的PmMYB1基因序列,该序列编码242个氨基酸。序列分析表明该蛋白具有保守的MYB结构域及花青素苷调控MYB蛋白特征基序,并且含有与bHLH转录因子相互作用的保守基序,可能需要bHLH蛋白协同表达共同完成花青素苷的合成调控。多序列比对和进化分析结果显示PmMYB1与其他已鉴定功能的花青素苷调控MYB蛋白有很高的同源性,其中与樱桃李的PcMYB10和欧洲甜樱桃的PaMYB10一致性分别为92%和91%。转基因烟草试验表明过表达PmMYB1基因显著提高了转基因植株花冠中花青素苷的含量(P<0.05),使其花冠颜色明显加深,实时荧光定量RT-PCR试验结果表明PmMYB1基因在转基因植株花中表达量高于叶中,过表达PmMYB1基因明显上调了烟草花中7个内源花青素苷合成通路结构基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3′H、NtDFR、NtANS、NtUFGT及2个调控基因NtAn1a和NtAn1b的表达量。【结论】在烟草中过表达PmMYB1基因能够显著上调转基因植株花中内源花青素苷合成通路结构基因和调控基因的表达,从而促进了其花中花青素苷的积累并导致花色加深,表明该基因在花青素苷合成过程中起重要调控作用。
[期刊] 草业科学
[作者]
杜灵娟 陈凯利 刘雅莉
花青素3-O-葡糖基转移酶(3GT)是花青素苷合成最后一步的关键酶,可把不稳定的花青素催化成花青素苷。本研究利用PCR技术从蓝色葡萄风信子‘亚美尼亚’(Muscari armeniacum)中克隆到一个3GT基因(Ma3GT),Ma3GT cDNA全长1 377bp,编码458个氨基酸,与其他植物的3GT蛋白序列相似性达55%64%。进化分析表明,Ma3GT与单子叶植物3GT聚为一类,与小苍兰(Freesia hybrida)、荷兰鸢尾(Iris hollandica)3GT亲缘关系最近。荧光定量PCR分
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张旭 吴小旭 张智慧 胡云捷 秦蕾 王勇
【目的】初步探讨Ac SCL4在洋葱成花中的功能,为解析洋葱成花分子调控机制提供理论基础。【方法】以长日生态型洋葱品系SB2为试验材料,根据已有的洋葱转录组数据,通过q RT-PCR筛选目的基因Ac SCL4后进行基因克隆,并对其进行生物信息学分析;构建Ac SCL4基因的过表达载体p B221-3300-Ac SCL4并转化农杆菌,采用花序浸染法浸染拟南芥,并对T3代纯系转基因植株进行表型分析和开花相关基因表达量分析。【结果】洋葱Ac SCL4基因CDS长1 515 bp,编码504个氨基酸;Ac SCL4蛋白N端高度变异,C端有GRAS结构域。聚类分析发现,Ac SCL4与石刁柏和棉花的SCL4蛋白亲缘关系较近。与野生型拟南芥相比,Ac SCL4过表达植株表现晚花表型。荧光定量PCR结果表明,与野生型拟南芥相比,Ac SCL4过表达植株开花调控基因CO和FT的表达量极显著下降。【结论】Ac SCL4通过调控CO及FT基因表达来抑制洋葱开花。
关键词：
洋葱 AcSCL4 基因克隆 开花调控
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
何学高 赵爱国 谢冬冬 黄晓华
【目的】克隆漆树(Toxicodendron vernicifluum(Stokes) F. A. Barkl.)叶片中的谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因并分析其结构特征,明确该基因编码蛋白的酶活性及该基因的抗逆性,为其功能研究提供理论依据。【方法】根据已有的漆树叶片转录组数据,利用RT-PCR克隆漆树GST基因,应用生物学网站对其所编码蛋白的理化性质进行分析,并构建系统进化树和三维结构模型;利用原核表达系统和Ni-NTA亲和层析技术表达、纯化漆树GST重组蛋白,并利用不同底物测定重组蛋白的酶活性;将原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),验证该基因对低温、高温、高盐、高渗透压等非生物逆境胁迫的耐受性。【结果】获得了漆树谷胱甘肽S-转移酶基因TvGST7(GenBank登录号为MK956145)的完整编码序列,开放阅读框为711 bp,编码236个氨基酸,分子质量为27.17 ku,理论等电点为5.25;进化树分析和三维结构模拟表明,TvGST7蛋白属于Lambda(L)亚家族。酶活性测定结果显示,重组蛋白TvGST7具有巯基转移酶活性;胁迫试验表明,TvGST7的表达能增强大肠杆菌对低温、高温、高盐、高渗透压等非生物胁迫的抗性。【结论】根据TvGST7重组蛋白具有巯基转移酶活性及TvGST7的表达提高了大肠杆菌对非生物胁迫的抗性,推测TvGST7基因在漆树中的表达对于维持漆树体内的正常代谢和清除非生物胁迫产生的氧化损伤起着重要作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋维源 侯钰 赵剑宇 刘小凤 张小兰
【目的】AtRPL是拟南芥果实发育调控网络中的重要基因,参与胎座框的形成。同源克隆黄瓜的RPL,进行表达模式分析,在拟南芥中异源过表达CsRPL,探究CsRPL的生物学功能。【方法】根据拟南芥AtRPL信息在黄瓜基因组数据库中比对,克隆得到黄瓜CsRPL;利用MEGA5.2对CsRPL与其他物种同源蛋白进行氨基酸序列比对;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及原位杂交技术检测CsRPL在黄瓜中的表达模式;在拟南芥中异源表达CsRPL,并对转基因植株进行表达和表型分析。【结果】在黄瓜中存在两个RPL,分别命名为CsRPL1和CsRPL2,均含有BELL-Domain、Homeodomain保守域和两个EAR-Motif。CsRPL1在黄瓜各个部位均有表达,在开放的雄花中表达量最高,且在果实生长前期,其表达量随着果实的发育逐渐降低;CsRPL2在黄瓜各部位表达量均显著低于CsRPL1。原位杂交显示CsRPL1/2在黄瓜果实的胎座框中表达,且杂交信号在茎尖分生组织(SAM)的Central zone(CZ)区域富集。拟南芥异源过表达CsRPL1/2转基因植株的果荚变短,花粉育性降低,且种子发育受到抑制。【结论】CsRPL1/2参与生殖器官的发育,且可能存在功能冗余,在正常生长条件下,CsRPL1优先发挥功能。相比于AtRPL,CsRPL1/2的功能并不完全保守。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周露 刘杨 崔群香 陈火英
[目的]本文旨在探索茄子SmICE1(Inducer of CBF expression 1)基因在低温响应和花青素合成途径中的功能。[方法]以光敏型茄子品种‘蓝山禾线’为材料，通过同源克隆获得SmICE1基因的全长序列，并对其进行生物信息学分析；4℃低温处理4叶期的茄子幼苗，分析SmICE1基因的表达水平；构建植物表达载体PHB-SmICE1-YFP,通过农杆菌介导法在烟草叶片中进行瞬时转化，研究SmICE1蛋白的亚细胞定位；通过农杆菌蘸花法在拟南芥中过表达SmICE1基因，分析转基因植株的耐寒性、生理指标及AtCBF(CRT binding factor)基因表达情况；将PHB-SmICE1-YFP农杆菌和SmCBFpro-LUC农杆菌菌液瞬时共转入烟草细胞中进行双荧光素酶试验；构建诱饵载体SmYABBY-pGBKT7和猎物载体SmICE1-pGADT7转化至酵母感受态AH109中进行酵母双杂交试验；构建植物表达载体SmYABBY-nYFP和SmICE1-cYFP,利用注射法将其农杆菌转化至烟草细胞中进行双分子荧光互补试验。[结果]克隆获得茄子SmICE1基因，其含有1 524 bp的开放阅读框，编码507个氨基酸，预测相对分子质量为54.75×10~3,理论等电点为5.6。多序列比对和进化树结果显示SmICE1与番茄SlICE1同源关系最近。荧光定量PCR表明SmICE1基因的表达受低温诱导。亚细胞定位显示SmICE1蛋白定位在细胞核中。SmICE1蛋白具有转录激活活性，双荧光素酶试验表明SmICE1可以促进SmCBF的表达。在拟南芥中异源过表达SmICE1基因可以增强植株的抗寒性。低温处理后，转基因植物的脯氨酸含量和AtCBF基因的表达量高于野生型，而电解质渗透率低于野生型。酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明SmICE1与SmYABBY蛋白存在相互作用。[结论]SmICE1可以诱导SmCBF表达并增加转基因植株的抗寒性，SmICE1与SmYABBY互作可能参与调控茄子花青素生物合成。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周露 刘杨 崔群香 陈火英
[目的]本文旨在探索茄子低温响应因子SmICE1在低温响应和花青素合成途径中的功能。[方法]以光敏型茄子品种‘蓝山禾线’为材料，通过同源克隆获得SmICE1的全长序列，并对其进行生物信息学分析；4℃低温处理4叶期的茄子幼苗，分析SmICE1的表达水平；构建植物表达载体PHB-SmICE1-YFP，在烟草叶片中进行瞬时转化研究SmICE1蛋白的亚细胞定位，通过蘸花法在拟南芥中进行SmICE1遗传转化，分析过表达植株的耐寒性、生理指标和下游CBF表达情况；将PHB-SmICE1-YFP农杆菌和含有SmCBF启动子序列(SmCBFpro)的pGreen-SmCBFpro农杆菌菌液组合导入烟草细胞中进行瞬时表达并进行双荧光素酶的测定；构建酵母载体pGBKT7-SmYABBY和pGADT7-SmICE1转化至酵母感受态AH109中进行酵母双杂交实验；构建植物表达载体SmYABBY-nYFP和SmICE1-cYFP，利用注射法将其农杆菌转化至烟草细胞中进行双分子荧光互补实验。[结果]克隆获得编码区长1524 bp的茄子SmICE1，其蛋白编码507个氨基酸，预测分子质量为54.75 kDa，理论等电点为5.6；多序列比对和进化树分析显示SmICE1与番茄SlICE1同源关系最近；SmICE1表达受低温诱导；亚细胞定位显示SmICE1蛋白定位在细胞核中；SmICE1蛋白具有转录激活活性，双荧光素酶实验表明SmICE1可以促进SmCBFs的表达；在拟南芥中异源过表达SmICE1可以增强植株的抗寒性。低温处理后，转基因植物的脯氨酸含量和AtCBFs基因的表达量高于野生型，而电解质渗透率低于对照；酵母双杂交和双分子荧光互补实验表明SmICE1与SmYABBY蛋白存在相互作用。[结论]克隆获得茄子SmICE1基因，功能分析表明SmICE1可以诱导SmCBFs表达并增加转基因植株的抗寒性，SmICE1与SmYABBY互作可能参与调控茄子花青素生物合成。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王伟 王俊 鲍玉月 栗春霞 崔智慧 韩英鹏 李文滨
大豆GmVE2基因是一种NAD(P)H脱氢酶,主要存在于高等植物叶绿体类囊体膜上,可参与氧化应激反应以及叶绿体PSⅠ电子循环传递。为了探究其功能,通过RT-PCR方法从东农50中克隆获得GmVE2基因的CDS全长序列。利用ExPASy-ProtParam等在线软件对GmVE2蛋白序列进行理化性质分析,预测结果表明,GmVE2基因编码区共编码167个氨基酸,分子式为C_(904)H_(1326)N_(208)O_(246)S_(10),分子质量为19.364 3 ku,总原子数为2 694,理论等电点(pI)为4.78,脂肪指数为87.01;蛋白正负电荷残基数分别为11和23;GmVE2蛋白的不稳定系数和GRAVY值分别为25.02和0.043,说明该蛋白是稳定的疏水性蛋白;蛋白存在跨膜结构、信号肽和磷酸化位点。将线性植物表达载体与目的片段进行连接,成功构建pCambia3300-GmVE2植物表达载体。通过qRT-PCR技术和高效液相色谱(HPLC)分别对动态籽粒及组织基因表达量和维生素E含量进行测定,结果表明,该基因表达量与生育期籽粒维生素E含量呈负相关(-0.951~*),且维生素E含量在绿色组织中显著高于其他组织。本研究对大豆基因GmVE2与维生素E含量的调控关系进行初步研究,为高大豆维生素E含量的大豆新品种选育提供理论和实践基础,为后期研究GmVE2基因功能提供科学依据。
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