为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合，以获得抗AKV的单克隆抗体；利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原，山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株，单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应，与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应；建立的检测AKV抗体ELISA检测方法，诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比，1∶50血清稀释比，1∶2 000二抗稀释比，封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性，小于44%为阴性；所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系，建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体，为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。

为建立噻菌灵酶免疫检测方法,制备3种噻菌灵的半抗原(H1、H2和H3)。利用活泼酯法制备免疫抗原H1-BSA、H3-BSA和包被抗原H1-OVA、H2-OVA、H3-OVA。采用杂交瘤细胞融合方法获得4株稳定分泌抗噻菌灵单克隆抗体的细胞株,分别命名为1-4G9、1-6D3、3-1F9和3-5D4。采用间接竞争酶联免疫法(IC-ELISA),将上述4株抗体分别与3种包被抗原进行组合,从中选择出一个最优组合:H3-OVA/1-6D3。据此建立的异源IC-ELISA检测方法对噻菌灵的IC50为10.9μg.L-1,检测限(IC10)为2.2μg.L-1,与3种噻菌灵类似物的交叉反应率均小于0.1%;...

以人工合成的强力霉素-牛血清白蛋白(DC-BSA)为抗原免疫BALB/C小鼠,用间接ELISA和间接竞争ELISA法选择细胞融合的备用小鼠;应用杂交瘤技术建立分泌DC McAb的杂交瘤细胞株,用体内诱生法制备DC McAb,并对DC McAb的免疫学特性进行鉴定;应用DC McAb建立检测DC的ciELISA方法,并对其相关特性进行检测。结果表明:筛选后获得1株分泌特异性抗体的细胞3D1-H4,细胞培养上清效价为1∶(8×102),腹水效价为1∶(5.12×105),抗体为IgG1型免疫球蛋白,与四环素、土霉素和金霉素分别有8.87%、5.86%和2.74%的交叉反应率,与其他抑制物无交叉反应...

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现，对养猪业造成了巨大危害，损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF，于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体，建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30，通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白，以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株；对P30蛋白进行截短表达，利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位；并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证，结果显示构建出重组载体pET-28a-P30，经测序其序列未发生突变；IPTG诱导后，P30重组蛋白主要表达在包涵体中，分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠，3次免疫后，小鼠血清效价达到1:102 400，说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆，获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞，Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点；截短表达P30蛋白不同片段，选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应，显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化，成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法，检测了190份临床样品，并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比，两方法阳性符合率为90.91%，总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白，经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株，抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高，敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法，为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。

罗氏沼虾肌肉白浊病(whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii)是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病,发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,死亡率高达60%以上。作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV)的基础上,用MrNV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,得到12株能特异分泌抗MrNV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞。注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶10...

【目的】制备鸭瘟病毒（ＤＰＶ）ｇＢ蛋白单克隆抗体，为建立ＤＰＶ快速诊断方法及进一步鉴定ＤＰＶ的抗原表位奠定基础。【方法】克隆ＤＰＶｇＢ基因，构建其表达载体并进行原核表达，纯化ＤＰＶ ｇＢ蛋白，以其作为抗原免疫８周龄ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，进行间接ＥＬＩＳＡ及亚克隆筛选，并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】ＰｃＲ扩增出９１５ＢＰ的目的基因，成功连接于ＰＥＴ－２８Ａ载体，并转化大肠杆菌ＲｏＳＥＴＴＡ进行诱导表达，获得４株稳定分泌抗ＤＰＶ ｇＢ蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为Ａ８Ｄ７、Ｅ６ｃ３、Ｈ１１Ｆ８、Ｈ６Ｆ６，间接ＥＬＩＳＡ检测其腹水效价分别为１∶１０３、１．．．

【目的】制备猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体,并对其进行鉴定和应用。【方法】以超离纯化的猪圆环病毒Ⅱ型作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,经间接ELISA筛选获得了2株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为8-60和10-48,对其生物学特性进行鉴定,并将其作为一抗,建立了间接免疫荧光诊断方法。【结果】8-60和10-48的染色体数平均为98～105对,间接ELISA检测其细胞培养上清液效价分别为1∶16和1∶32,小鼠腹水效价分别为1∶3×212和1∶3×213,抗体的免疫球蛋白亚型均为IgM。间接免疫荧光结...

利用重组CP作抗原制备出马铃薯A病毒的多克隆抗体,并将其用于DAS-ELISA检测。以p ET22b(+)为起始载体,构建了PVA-CP基因的原核表达载体p ET22b-ACP,重组菌BL21(p ET22b-ACP)经IPTG诱导表达出了分子量为30 k Da的特异性重组CP。利用高纯度重组CP为抗原免疫家兔,制备出了效价为1∶512 k的抗血清。以PVA重组CP为抗原,用间接ELISA与直接ELISA分别测定重组CP纯化抗体(Ig G)及其碱性磷酸酶标记物(Ig G-AP)的活性,用DAS-ELISA

【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单...

将伪狂犬病毒Ea株纯化后免疫雌性Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O的骨髓瘤细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选,获得了2株抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3G7E3和4A6F5,其细胞培养上清及小鼠腹水效价(ELISA)分别为1:212、1:212及1:100×212、1:100×212。特异性试验和免疫荧光结果显示,3G7E3和4A6F5仅与PRV反应,而与PPV、PRRSV、JEV和HCV等病毒不发生交叉反应;用单抗建立的夹心ELISA试验能检出伪狂犬病毒。表明本研究所获得的2株单抗是PRV特异性的。这2株分泌抗PRV单抗的杂交瘤细胞株的获得为进一步建立...

【目的】制备抗鸭副粘病毒(DPMV)的单克隆抗体,为鸭副粘病毒病免疫学诊断方法的建立奠定基础。【方法】采用差速和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯DPMV,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞株SP2/0融合,采用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和血凝抑制(HI)试验等方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并测定其生物学特性。【结果】筛选到7株能稳定分泌抗DPMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为J28、F4、B3、E39、E41、A12和A30。这7株单克隆抗体都具有ELISA和1FA特性,其中J28和F4还具有HI和中和特性。免疫球蛋白亚类测定结果显示,J28和F4均为IgG1,其他5株均...

为对猪瘟病毒(CSFV)建立更加有效的临床检测方法。用纯化的猪瘟兔化弱毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA方法筛选和3次亚克隆,最终获得了5株能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:C7,C9,G9,G10和4E8,其分泌的单克隆抗体(McAb)为IgG1(G9,4E8)和IgG2a(C7,C9,G10)亚类。经鉴定,5株单抗细胞培养上清效价为1∶1 600~1∶3 200,腹水效价为1∶51 200~1∶102 400。交叉试验及特异性抗原阻断试验表明,所制备的McAb与其他抗原无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒(CSFV)抗原决定...

制备抗大鲵虹彩病毒（ＣＧＳＩＶ）ＭＣＰ ＣＯＥ蛋白的单克隆抗体，并对其基本特性进行鉴定及开展初步应用。用纯化的重组ＣＧＳＩＶ ＭＣＰ ＣＯＥ蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，间接ＥＬＩＳＡ法检测阳性孔，经有限稀释法亚克隆，筛选单克隆杂交瘤细胞株。采用间接ＥＬＩＳＡ法、免疫印迹法和单克隆抗体亚型检测试剂盒等鉴定单抗的稳定性、特异性和亚型；采用腹水诱生法制备单抗腹水，饱和硫酸铵法纯化腹水单抗；间接ＥＬＩＳＡ法分别测定单抗杂交瘤细胞上清液和腹水单抗的效价；利用间接免疫荧光法观察ＣＧＳＩＶ的增殖。结果显示，细胞融合克隆率为９８．６８％，阳性率为２０．５２％，得到１株．．．

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒（Ｄｕｃｋ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＤＴｍｕｖ）Ｎｓ５蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的ＰｅＴ２８ａ－Ｎｓ５载体转化入ｒｏｓｅＴＴａ（Ｄｅ３）感受态细胞中进行诱导表达，利用纯化的鸭坦布苏病毒Ｎｓ５蛋白作为抗原免疫ｂａＬｂ／ｃ小鼠，应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗，并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得２株稳定分泌针对ＤＴｍｕｖ的Ｎｓ５蛋白单抗的杂交瘤细胞，分别命名为ａ４Ｄ１和ｂ４ｂ８。此２株杂交瘤细胞诱导ｂａＬｂ／ｃ小鼠的抗体效价均可达到１∶６４ ０００。间接ｅＬｉｓａ、ＷｅｓＴｅｒＮ ｂＬｏＴ和间接免疫荧光（ｉＦａ．．．

[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于³⁰GENRCWVRAIDVGYMC⁴⁵，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。