以赤桉组培苗为材料，通过PCR扩增eca-miRn33前体基因序列，结合5′RLM-RACE和烟草瞬时表达分析其对靶基因EcaICE1的剪切特征，并利用实时荧光定量PCR分析叶片和茎干中eca-miRn33与靶基因EcaICE1在低温胁迫下的表达模式。结果显示：赤桉eca-miRn33前体基因序列全长60 bp,可形成典型的发卡结构，eca-miRn33成熟序列位于其前体的5′端；5′RLM-RACE和农杆菌介导的烟草瞬时表达试验结果表明eca-miRn33可靶向剪切EcaICE1;eca-miRn33表达量与EcaICE1表达量之间呈显著负相关。

【目的】异形叶性是植物为适应环境在同一植株上产生多种形态成熟叶片的现象。胡杨是典型的木本异形叶植物,前人研究发现,胡杨异形叶片间展现出不同的生理特性及环境适应性。本研究拟通过对胡杨异形叶差异表达miRNA及其靶基因功能的分析,揭示胡杨叶片形态及其生理变化的分子调控机制。【方法】以成年胡杨披针形叶和锯齿卵圆形叶为实验材料,通过高通量测序对其miRNA的表达模式及差异表达miRNA的靶基因功能进行比较研究。【结果】共获得6个高质量的sRNA文库,各文库有效序列占原始序列的56%～81%。通过比对,共鉴定517个已知miRNA和127个新预测miRNA,主要长度分布区间为20～22 nt,其中的389个miRNA匹配至54个已知的miRNA家族。两种形态叶片共同检出的miRNA有369个,与披针形叶片相比,锯齿卵圆形叶中7个miRNA上调表达,15个下调表达。通过靶基因预测及功能分析,发现差异表达miRNA参与调控胡杨异形叶的抗逆相关途径,如对盐胁迫的响应,磷酸肌醇代谢,角质、软木脂和蜡的生物合成,碱基切除修复和RNA降解等代谢途径。利用实时荧光定量PCR验证了5个差异表达miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致,通过PCR检测发现差异表达miRNA与其靶基因存在一定的负调控关系。【结论】胡杨异形叶中miRNA表达模式存在差异。其中,调控植物生长发育的保守的miR167、miR166及调控植物抗逆性的miR172在锯齿卵圆形叶中表达量上调,参与植物逆境响应的保守的miR169、miR396在锯齿卵圆形叶中下调表达,推测差异表达miRNA引起了异形叶间形态的差异,同时使锯齿卵圆形叶对不利环境具有较强的耐受性。这与我们前期有关胡杨异形叶形态与生理特性的研究结果相一致。

【目的】NAC(NAM,ATAF和CUC2蛋白)是植物中一类特异转录因子,广泛参与植物生长、发育、激素信号转导和逆境响应过程。本文通过对巨桉EgrNAC1(Eucgr.I00058)编码蛋白结构、蛋白亚细胞定位特点,以及低温、干旱和高盐等非生物逆境条件下的基因表达分析,研究EgrNAC1基因与非生物逆境响应的关系,为其功能的深入研究提供基础。【方法】首先从巨桉基因组数据库下载EgrNAC1基因、启动子和编码蛋白序列,利用SMART、MatInspector和MEGA等软件对EgrNAC1蛋白结构特征、进化

[目的]鉴定葡萄miR396家族成员（VvmiR396s）及其靶基因VvGRF1，探究VvmiR396s-VvGRF1在种子败育/发育中的作用模式。[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396s及其靶基因，生物信息学分析其潜在功能与进化保守性，RT-qPCR 检测VvmiR396s在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396s-VvGRF相关性差异。[结果]与‘魏可’葡萄相比，‘京可晶’葡萄花后28 d种子发育被严重抑制，出现败育且种子萎缩，而前者种子正常发育。对VvmiR396a/b/c/d 的前体及其成熟体序列进行鉴定，VvmiR396a/b/c/d前体均可形成典型的茎环结构，成熟体序列均位于茎环的5′臂上。VvmiR396a/b/c/d 与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近，而与小麦的亲缘关系较远。预测到VvmiR396s的8条潜在靶基因，利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1/10是VvmiR396s的真实靶基因，且后者对前两者的裂解位点及频度分别为10~(th)(19/22、5/25)/11~(th )(2/22、2/25)和9~(th)(17/21、3/20)/11~(th)(2/21、1/20)；进一步利用烟草共转化体系对它们的裂解作用进行了活体验证，并发现VvmiR396s对VvGRF1的裂解作用强于VvGRF10，故在此重点研究其对VvGRF1的作用。靶基因VvGRF1蛋白与胡杨、毛白杨、荷花、烟草等物种的亲缘关系较近，且不同物种的GRF1均含有QLQ、WRC两个结构域；VvMIR396s和VvGRF1的启动子上都有多种激素（生长素、赤霉素、脱落酸等）响应元件，说明其可能通过响应激素信号从而调控生长发育；定量结果发现，在‘京可晶’种子败育过程中，VvmiR396a/b/c/d的表达量逐渐升高，且在败育关键期（花后42 d）有最高表达，而VvGRF1呈现相反表达模式；而在有核品种‘魏可’种子发育中，VvmiR396s呈现下降的趋势，在花后42 d有最低表达，靶基因表现相反的表达模式，表明VvmiR396s可能介导VvGRF1正调控葡萄种子败育，而负调控种子的发育；进一步相关性分析发现，‘京可晶’种子败育中VvmiR396b与VvGRF1的负相关性最高，表明VvmiR396b对VvGRF1具有最强的负调控作用，且VvmiR396b-VvGRF1可能是葡萄种子败育的主要调控模块。[结论]在假单性结实葡萄‘京可晶’中，鉴定到VvmiR396a/b/c/d 4个成员；VvmiR396b-VvGRF1可能是参与调控葡萄种胚败育的调控途径。

【目的】深入挖掘巨桉脱水素基因EgrDHN家族成员并探讨其应对逆境胁迫的表达模式，从中筛选具有抗逆功能的EgrDHN基因对于培育桉树抗逆新品种具有重要意义。【方法】以巨桉全基因组数据为参考，利用生物信息学筛选鉴定得到巨桉EgrDHN基因家族成员，对其进行生物信息学分析，具体包括进化树分析、蛋白序列比对、启动子顺式作用元件预测等，并基于生信分析结果，对EgrDHN基因家族成员进行低温、高盐和ABA胁迫处理，采用RT-qPCR测定其表达模式，同时对其组织表达特异性进行了测定。【结果】从巨桉基因组中共鉴定出EgrDHN家族9个成员，将其命名为EgrDHN1～EgrDHN9，分布于5条染色体上，根据蛋白质保守序列的特点可分为K_nS、SK_n和Y_nSK_n 3种类型。系统进化树显示植物DHN家族成员可分为4个进化枝，其中第Ⅳ进化枝包含巨桉EgrDHN7、EgrDHN8、EgrDHN9，但不包含任何毛果杨Populus trichocarpa DHN同源基因（PtrDHNs），两者存在明显差异。启动子元件预测分析发现巨桉EgrDHN启动子中含有低温响应（low-temperature response,LTR）等胁迫响应类元件，MYB、MYC等与抗逆性相关以及植物激素响应类顺式作用元件。组织特异性表达分析发现EgrDHN家族成员在根、成熟叶片、子叶中表达量较高，其中EgrDHN2在成熟叶片中表达量最高。非生物逆境胁迫下经RT-qPCR检测发现EgrDHN家族成员中，EgrDHN1在高盐胁迫下表达量下调，在低温和ABA胁迫时上调，而其他成员在低温、高盐、ABA胁迫下均存在上调，其中低温条件下以EgrDHN2、EgrDHN3、EgrDHN4响应最为明显。【结论】大部分EgrDHNs基因参与逆境胁迫响应，且除EgrDHN1在盐胁迫下的表达量下降外其它成员在逆境胁迫下的表达量均上升。

为进一步探讨MADS-box基因家族在牡丹花器官发育和开花时间调控中的功能提供理论依据,为培育早花品种提供候选基因。以RACE扩增获得Ps AP1基因的全长c DNA为基础,分析了其表达模式和功能,以牡丹课题组利用454测序得到的类AP1基因的部分c DNA序列为基础,利用RACE扩增方法获得1 130 bp牡丹Ps AP1基因全长c DNA,同源性分析表明,牡丹Ps AP1与葡萄Vv AP1的相似性最高,为80.4%。实时定量PCR分析了其初花期的表达模式,结果表明,Ps AP1基因在萼片中转录量最高,其次为花瓣,在雄蕊中表达量最低。将Ps AP1基因在拟南芥中异源表达,分析鉴定了3个转基因...

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coliF18菌株感染下表达量极显著上调的micro RNAs—miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守...

甘露糖受体C1型基因(mannose receptor C-type 1， MRC1)是C型凝集素超家族的成员之一，其编码的甘露糖受体是一种模式识别受体，在先天免疫反应中发挥关键作用。MRC1基因在哺乳动物免疫反应中的作用被广泛研究，但在鱼类中的研究较少。近年来，随着高密度集约化养殖模式的发展，由病原微生物引发的疾病频繁暴发，其中嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是常见的致病菌之一。本研究首次在鲤(Cyprinus carpio)全基因组范围鉴定MRC1基因，共发现11个基因拷贝，并进行了功能域预测、共线性分析、多序列比对和系统进化分析，结果表明MRC1基因在物种进化过程中保守程度较高。拷贝数比较分析发现，MRC1基因在不同物种中表现出不同程度的多拷贝现象，在多数鱼类中发现2个拷贝，而在鲤中发现多达11个拷贝。同时，比较了各拷贝在健康鲤脑、肌肉、肝脏和脾脏组织中的表达情况，发现在免疫相关组织脾脏中的表达量相对高于其他组织。进一步对感染嗜水气单胞菌4、12、24 h后在鲤脾脏中的表达进行差异比较分析，发现不同拷贝的表达特征各有差异，其中，HHLG13g0734在感染嗜水气单胞菌4 h后表达显著上调，HHLG13g0734在感染24 h后表现出极显著上调，HHLG3g0497在整个感染过程中表达显著下调，表明鲤MRC1基因只有部分拷贝保留了免疫相关功能及参与机体的免疫反应。本研究结果有助于进一步了解鲤MRC1基因在抵抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥的免疫功能，并为分子选育抗病新品系提供一定的数据基础。

[目的]研究油菜素内酯受体BRI1的同源基因(JcBRI1)在麻疯树花发育过程中的作用。[方法]利用RT-PCR技术克隆JcBRI1基因的CDS,以pET-30a(+)质粒为框架构建原核表达载体转化至大肠杆菌进行诱导表达,随后利用LC-MS/MS对表达产物进行质谱鉴定,并以氨基酸序列为基础分析JcBRI1蛋白质结构。利用荧光定量PCR分析麻疯树JcBRI1基因在雌雄花发育的关键时期的表达水平,初步确定其在麻疯树花发育过程中的表达模式。[结果]克隆获得了JcBRI1基因的CDS,长度为3 591 bp。SDS-PAGE检测结果表明:JcBRI1基因在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中均能表达,但在低温环境的表达量更高。原核表达产物的LC-MS/MS鉴定结果表明:JcBRI1氨基酸序列与预期的一致,JcBRI1基因的表达产物为麻疯树BRI1蛋白。对JcBRI1在麻疯树花器官不同发育时期的表达水平进行检测分析,结果表明:JcBRI1基因的表达量在雌花发育的第一个时期即大孢子母细胞时期就达到了最高值,在随后几个时期持续下调;然而,其在雄花各个时期的表达量并无明显差异,表明其很有可能参与了麻疯树雌花大孢子母细胞发育过程。[结论]麻疯树JcBRI1基因为LRR-RLKs家族成员BRI1的同源基因,很有可能参与麻疯树雌花大孢子母细胞的发育过程,至于JcBRI1在麻疯树大孢子母细胞发育过程中的具体作用机制还需进一步研究。

利用非洲爪蟾卵母细胞对橡胶树水通道蛋白基因HbPIP1和HbPIP2进行功能鉴定,发现HbPIP1具有快速水分传输功能而HbPIP2不具该功能。推测HbPIP1基因表达可能与乙烯利刺激橡胶树增产机制有关。因此,选择对乙烯利较敏感的橡胶树PR107品种,利用RT-qPCR和Western blot技术检测HbPIP1在转录和翻译水平的表达变化,探讨其与乙烯利刺激后橡胶树排胶体积、排胶时间、干含和总固形物变化的关系。结果表明:HbPIP1在树皮、胶乳和次生木质部中具有较高的表达量;胶乳中HbPIP1的表达量随乙烯利刺激时间延长呈上升趋势,而树皮中HbPIP1的表达量则呈降低的趋势;乙烯利通过调节H...

[目的]本文旨在研究大白菜环核苷酸门控离子通道基因(BrCNGC)的进化关系、结构特征、染色体定位及其表达模式。[方法]通过生物信息技术对大白菜BrCNGC进行分子进化分析、功能结构分析、染色体定位分析、保守结构域分析,并且通过荧光定量PCR分析该基因家族在脱落酸(ABA)+芜菁花叶病毒(TuMV)、水杨酸(SA)+TuMV、茉莉酸甲酯(MeJA)+TuMV和抗坏血酸(AsA)+TuMV处理下的表达差异。[结果]大白菜BrCNGC家族有26个成员,可分为4个组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),其中第Ⅳ组又可以分为2个亚组(Ⅳa和Ⅳb)。它们分布在9条染色体上,1号染色体上BrCNGC数量最多(有5个),5号染色体上只有1个BrCNGC基因,而8号染色体上没有BrCNGC基因分布。基因结构分析表明:该家族基因中共鉴定出10种motif,其中有14个BrCNGC蛋白都包含这10种motif,同组成员之间的motif组成相似。荧光定量PCR结果表明:在植物生长调节剂与TuMV相互作用下,大部分BrCNGC的表达量上调,少数BrCNGC的表达量下调。[结论]大白菜BrCNGC结构高度保守,其在大白菜抵御TuMV侵染过程中发挥一定的作用,该发现为以后进一步研究BrCNGC的功能奠定了基础。

【目的】了解家蚕细胞中上调miRNA的方法及靶基因预测,为家蚕miRNA的功能研究提供方法参考。【方法】构建家蚕miR-14的真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14并在家蚕BmN细胞中表达,同时通过转染化学合成的miRNA mimics上调BmN细胞中miR-14的水平。首先通过PCR扩增miR-14的前体及其侧翼序列(pri-mir-14)并克隆至真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP的EGFP基因下游。分别将重组质粒pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14、对照质粒pSK-hr3-ie1-EGFP、bmo-miR-14 mimics和nega...

【目的】鉴定杨树受低氮胁迫后miRNA的靶基因,分析靶基因在氮胁迫后的差异表达并探讨其功能,为揭示杨树低氮胁迫下miRNA的调控功能提供参考,并为树木低氮营养高效利用育种提供重要的候选基因。【方法】根据miRNA的保守性及与靶基因的严谨互补配对关系,以杨树miRNA为探针利用靶基因预测软件psRNATarget,通过与毛白杨转录组的基因序列进行比对鉴定靶基因,进一步开展毛白杨受低氮胁迫后靶基因的差异表达分析及功能注释。【结果】获得了131个miRNA家族的242个miRNA成员对应的3 024个靶基因,分别参与了植物激素信号转导、次生代谢产物的生物合成、氨基酸合成代谢、碳代谢和RNA运输等通路。57个靶基因在低氮胁迫处理后发生显著变化,其中受到诱导(29个)和抑制(28个)的基因数目相当。14个低氮胁迫响应的miRNA,其对应的11个靶基因也发生了显著的差异表达变化,其中miRNA和靶基因表达量发生相反变化的有8个miRNA。本研究发现参与植物激素信号转导的靶基因(2个)及参与代谢途径的靶基因(6个)发生了差异表达。miR162的靶基因编码ABC转运蛋白,miR393运用于靶基因KAT2调节Na+和K+动态平衡,miR399的靶基因PIF3编码光敏色素互作因子PIFs蛋白,这些miRNA及靶基因可能在杨树响应低氮胁迫中发挥重要作用。【结论】本文鉴定到了毛白杨中一批低氮胁迫响应miRNA的靶基因,可调控杨树对氮逆境胁迫信号的反应。这些miRNA及靶基因为进一步揭示miRNA及靶基因在低氮胁迫下的调控功能提供了研究线索,为树木氮营养的高效利用改良提供了重要候选基因。

　在获得HLA-G1cDNA克隆序列的基础上,构建了pGEX-4T2-HLA-G1原核表达载体,对HLA-G1的诱导表达发现,融合蛋白以包涵体形式存在于表达菌中。进一步溶解包涵体,改善复性条件,最终获得高纯度的GST/HLA-G1融和蛋白。51Gr释放试验表明,纯化的HLA-G1具有抑制NK细胞对靶细胞的杀伤活性。

【目的】对猪脂肪组织RNA的Solexa测序结果进行分析整理,发现猪新转录本CHPT1基因。研究CHPT1在猪不同组织及脂肪细胞不同分化阶段的表达谱,以便为后续的基因功能研究奠定基础。【方法】取猪的背部脂肪组织提取RNA,建立cDNA文库,进行Solexa测序,对测序结果进行生物信息学分析。利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及实时荧光定量PCR,克隆猪CHPT1基因的CDs区部分序列,并对其在不同组织及脂肪细胞不同分化阶段的表达谱进行分析。【结果】由Solexa测序分析结果发现,猪存在新转录本基因CHPT1,其对应的Tag表达量在180日龄大白猪与240日龄荣昌猪的脂肪组织中无明显差异,...