为了解马铃薯Y病毒在贵州烟田的发生和流行规律,对2013—2015年采集到的贵州省多个烟区呈现典型茎脉坏死症状的疑似受马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染的烟草样品进行单斑分离和病毒鉴定,并以现有PVY序列信息为参考,设计了4对PVY特异引物,经过RT-PCR扩增、T载体连接、序列测定以及序列拼接,并利用MEGA软件进行系统进化分析。结果发现PVY福泉分离物(PVY Fuquan isolate,PVY-FQ)和PVY大方分离物(PVY Dafang isolate,PVY-DF)为优

本文通过一步法RT-PCR技术,检测新疆加工番茄马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)感染率。结果表明,新疆加工番茄马铃薯Y病毒感染率为25%。选取10个样品利用RT-PCR技术,克隆CP基因,获得807 bp全长CP基因,编码268个氨基酸。CP基因序列比对分析与系统进化树分析表明,侵染新疆加工番茄的马铃薯Y病毒属于PVYN:O株系。

根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保...

【目的】本研究通过对不同PVY分离物基因的测序及分析,了解青海省PVY株系特点,进而对PVY病毒的分子检测和预防控制提供理论基础。【方法】采用RT-PCR扩增的方法,对青海省18个PVY的P1基因进行克隆测序和进化树分析。【结果】P1目的基因共825个碱基,编码275个氨基酸;经比对样品的P1基因序列,核酸一致率达90.3%～100.0%,其中Y-39、Y-47和Y-513个样品与其它样品有55～61个碱基的差异;试验样品与国内外已报道的PVY P1基因相比较,经进化树分组后,主要分为A、B、C 3组,其中A组包含了大部分来自青海的样品,是本地区的优势组群;而另一组4个样品的P1基因与本地优势组群有较大差异,且4个样品间也有一定的差异。通过与GeneBank中已上传的序列提供的信息相比对,发现14个样品的P1基因与PVY~(N-Wi)株系较近;其余4个样品与PVP~(NTN)株系较近。【结论】由P1基因分析表明,青海省马铃薯Y病毒株系具有地域特点,另外的4个样品说明青海PVY有可能是不同区域间种薯调运以及PVY本身重组特性而产生的。

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PC...

为明确马铃薯S病毒内蒙古分离株(Potato Virus S-Inner Mongolia,PVS-IM)3'端序列结构的特点,通过在马铃薯S病毒亚基因组增强子保守区域设计引物,运用3'RACE技术获得了马铃薯S病毒内蒙古分离株3'端序列。比对显示PVS-IM分离株属于PVSO(Ordinary)株系,为有针对性的防治病害以及预测产量损失提供依据;分析还发现PVSO和PVSA(Andean)两株系在外壳蛋白氨基酸N端和亚基因组增强子区域也存在可以区分两株系的差异,为区分两株系提供参考,也为PVS基因组功能以及作用机制的研究奠定基础。

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列(coding sequence,CDS),利用MEGA 6.0进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。

根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,经RT PCR法扩增出全长的cDNA片段,结果从感病组织中扩增出与预期的360bp大小的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将其克隆到质粒pGEM T载体上,进行全序列分析。结果表明,与国内外的报道相比较,核苷酸同源率高达98%以上。PCR产物克隆作为RT PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,为进一步进行抗PSTVd基因工程研究打下了良好基础。

以马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为材料,用RACE方法,获得了类毒液过敏原蛋白新基因Dd-vap-2的cDNA全长(GenBank登录号为GU370352)。该cDNA全长序列为1 150 bp,包括1个912 bp的完整ORF,编码1个含303个氨基酸的蛋白,其理论分子质量为31.8 ku,等电点pI为6.76。序列比对分析表明,De-vap-2基因含有保守性结构域,属于富含半胱氨酸分泌蛋白(cysteine-rich secretory protein,CRISP)家族成员,N端具有21个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明,该基因与马铃薯金线虫(G...

从云南省弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝，植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ（Ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ），在红花大金元品种中以ＴＭＶ普通株作对照进行致病力测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒ＲＮＡ云南强毒株系为模板，根据国内外研究结果自行设计、合成寡核苷酸引物，通过ＲＴ—ＰＣＲ体外扩增，Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α克隆，获得了云南烟草５４ＫＤ（ＴＭＶ复制酶）全基因片段。顺序分析表明：该基因含１４２５个核苷酸，编码４７５个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，ＤＮＡ同源率为９９．０％，氨基酸同源率为９８．９％，与国内普通株比较，ＤＮＡ同源率为９９．１％，氨基酸同源率为９８．９％。

从云南弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝植斑分离，经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ；在烤烟品种红花大金元上以ＴＭＶ普通株作对照进行致病率测定，确定为强毒株系。以烟草花叶病毒（ＴＭＶ）云南强毒株系ＲＮＡ为模板，根据国外研究结果，自行设计、合成寡核苷酸为引物，通过ＰＴ－ＰＣＲ体外扩增，得到约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段，将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α上，并进行了序列分析。分析表明，该其因含４７７个核苷酸，编码１５９个氨基酸，与国外发表的Ｕ１株系比较，核苷酸同源率为９８．１％，氨基酸同源率为９７．５％。获得了云南烟草ＴＭＶ外壳蛋白全基因片段。

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)gE基因序列设计并合成1对引物,以烟台株为模板,用PCR法扩增出1条1.5kb的基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体中。经电泳分析、酶切鉴定,将得到的重组质粒命名为pMD-gE并进行序列测定。将测序结果与ILTV美国标准攻毒毒株和中国王岗株,BHV-1,EHV-1,FHV-1,HHV-2,HHV-3,HVT,MDV-1,MDV-2,PRV的gE基因比较,发现核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%~11.9%和99.4%~15%。结果表明,不同ILTV毒株之间gE基因还是比较保守的,但不同疱疹病毒之间,gE基因的同源性较低。

为了确定河南部分地区按照正常免疫程序接种猪伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失苗的猪场是否发生了PRV野毒感染,了解新流行株的主要毒力基因g E是否发生变异,利用PCR方法,对南阳、周口、巩义、济源、漯河、原阳等地采集的疑似PRV感染的病料进行检测。对PCR检测为阳性的病料接种猪睾丸细胞,传至6代,分离出9株PRV,克隆其g E全基因并进行序列分析。结果表明,9株PRV均能扩增出1 862 bp的g E基因,且彼此之间同源性为99.9%~100%,与其他PRV毒株同源性为97.5%~99.6%。9株分离株处于一大分支上,且均含有2个氨基酸插入,在448位和510位均发生氨基酸置换。结果表明,分离株均...

采用RT-PCR和重组PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)TSX毒株纤突蛋白(spike protein,S)基因全长cDNA序列,分离纯化PCR产物,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pGEM-S,并对其进行酶切鉴定和测序,对测序结果及推导氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,S基因全长为4 350 bp(GenBank登录号DQ001167),编码1 449个氨基酸,N端前16个氨基酸为推测的信号肽序列,其后1 433个氨基酸构成成熟蛋白;与GenBank中已发表的9个TGE...

中国明对虾肝胰腺细小病毒是一种单链、线性DNA病毒。本研究利用DNA末端加尾和嵌套PCR首次完成了对虾肝胰腺细小病毒(hepatopancreatic parvovirus,HPV)中国分离株(HPV-Pc)全基因组序列的测定,研究结果表明,HPV-Pc株(GenBank登录号GU371276)的全基因组由6 085个核苷酸组成,包含3个开放阅读框(ORF)(分别代表ns1、ns2和cp基因)和2个非编码区。ORF1、ORF2和ORF3分别编码由427、578和821个氨基酸组成的蛋白,分子量分别为50.4 kD、68.2 kD和92 kD。分析HPV-Pc基因组结构,发现该基因组没有末端反向...