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[期刊] 中国水产科学
[作者]
汪登强 罗晓松 陈大庆
采用CloneMinerTMcDNA文库构建试剂盒构建了患败血症的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肝和肾的cDNA文库。经检验,文库的滴度为1.34×107 cfu/mL,总库容为2.68×107 cfu,阳性克隆率为97.5%,平均插入片段大于1.2 kb。对80个随机挑选的克隆进行两端测序,结果显示有74个测序成功。经在GenBank上BLAST比对,其中57个为已知功能基因,属于45个不同基因,另外17个没有明显的同源序列。在已知功能的57个克隆中,含有全长编码区序列的克隆共有49个,全长cDNA比率为61.25%。采用PCR法对文库进行筛选,获得一个含MHC...
关键词：
鲢 cDNA文库 MHC 肝 肾
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周凯 张成锋 王建新 李冰 朱健
采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法克隆了建鲤(Cyprinus carpio var.jian)MHC classⅠ基因全长cD-NA并进行了序列分析。结果显示:实验得到了1914 bp的建鲤的MHC classⅠ全长cDNA序列;建鲤MHC classⅠ基因包括1044 bp的开放阅读框(ORF),118 bp的5'非编码区(UTR)以及752 bp的3'非编码区(UTR),含有保守的半胱氨酸残基,N-糖基化位点。氨基酸序列比对结果显示,建鲤MHC classⅠ与日本鲤的MHC classⅠ相似性最高,为66.0%;与虹鳟、大西洋鲑、青鳉、红鳍东方鲀的相似性分别为54.5%、57.9...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
苏建明 肖调义 张学文 陈韬 章怀云
采用快速扩增cDNA末端方法,获得1007bp草鱼MHCⅡα基因全长cDNA片段,序列包括717bp的开放阅读框、34bp的5′端非编码区以及256bp的3′端非编码区.氨基酸序列比对和同源性比较分析结果表明,草鱼MHCⅡα与鲤鱼MHCⅡα相似性最高,为79%,与斑马鱼的相似性为75%,与人的相似性最低,为34%.RT-PCR组织表达分析,MHCⅡα基因在正常草鱼组织中除了肌肉中没有扩增出MHCⅡα基因转录本外,在所检测的其他组织中都有不同程度的表达,其中脾脏、头肾有较强的表达,血液有中等程度的表达,肝脏、眼与肌肉相对表达较弱.
[期刊] 淡水渔业
[作者]
叶显峰 孟凡涛 刘洪明 祖国掌
为研究鱼类恒定链(Invariant chain,Ii)的结构与功能,应用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNAends)法,从脾脏细胞中克隆了鲢(Aristichthys molitrix)Ii基因cDNA,并进行了测序。该基因cDNA全长为1 136bp,其中开放阅读框为699 bp,编码232个氨基酸。比对氨基酸序列发现,鲢与其他物种的Ii链有相同的结构域。将Ii基因cDNA片段和表达不同结构域的DNA片段分别插入真核表达质粒pEGFP-C1,转染真核细胞系COS7,发现鲢Ii跨膜区和胞浆区在细胞内具有定位作用。根据推测的氨基酸序列,分析不同种间I...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
丁为群 梁宏伟 邹桂伟 王晓阳 曹磊 刘迪秋 李忠
【目的】克隆鲢胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)基因,分析其编码蛋白的结构与功能,并分析低氧胁迫下该基因在鲢肝脏中的表达情况。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNAends,RACE)扩增鲢IGFBP-1基因的全长cDNA,通过半定量RT-PCR法对鲢肌肉、心脏、脑、肾脏、肝脏、腮和脾等组织器官IGFBP-1mRNA的表达水平进行检测,利用Real-time PCR法检测急性低氧胁迫0,2,4,6,8,10和12h后鲢肝脏组织中IGFBP-1表达量的变化。【结果】鲢IGFBP-1全长cDNA为1 081bp,具有73bp的5′非编...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘学东 张子栋 郑冬 马建章
【目的】从功能基因组学角度深入研究鹿茸软骨组织生长发育机理,探讨胰岛素样生长因子-II(IGF2)在鹿茸软骨组织生长发育过程中的作用。【方法】利用SMART技术构建了东北马鹿鹿茸软骨组织全长cDNA文库,并设计IGF2基因保守引物对该文库进行筛选。【结果】构建的未扩增文库滴度为1.8×106pfu·ml-1,文库重组率大于89.8%;插入片段平均长度约为1.2 kb;扩增文库滴度为1.4×1010pfu·ml-1;克隆东北马鹿IGF2基因(GenBank登录号:EF177491)CDS区为540 bp,编码179 aa长度的多肽,与GenBank中检索得到的猪、马、牛、羊、人、小鼠和大鼠IGF...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张新中 吴灶和 简纪常 鲁义善
应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST。以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减cDNA文库。利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2424个含插入片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定。使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释。结果获得了30个与红笛鲷免疫防御相关基因的EST,...
[期刊] 水产学报
[作者]
龚小玲 鲍宝龙 杨桂梅 任大明
在前期的研究中,克隆到牙鲆变态早期和变态前差异表达的parvalbumin基因片断cDNA。为了克隆parvalbumin基因的全长cDNA,构建了变态早期(孵化后23d仔鱼)牙鲆头部的全长cDNA文库,并对文库的滴度和插入片段大小进行了评估。同时采用锚定PCR法从cDNA文库筛选出parvalbumin基因的全长cDNA。结果表明,所构建的牙鲆变态早期头部cDNA文库的滴度为1.2×106PFU·mL-1,插入片段的平均长度为1000bp左右。parvalbumin基因的全长cDNA的长度为603bp,编码109个氨基酸,含有两个EF手型钙离子结合域:DQDGSGFIEEEEL(52～64)...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
任禛 尹敏 夏体渊 陈泽斌 尹利方 韩丽 靳松 王定康
【目的】本文研究了玫瑰根系的AMF多样性和组成结构。【方法】从昆明学院种质资源圃随机采集玫瑰‘卡罗拉’3株,采用CTAB法提取根系DNA,运用巢式PCR扩增AM真菌部分18S rRNA基因区域,扩增产物混合后构建克隆文库,最终确定30个阳性克隆子测序,并对文库进行评价和分析。【结果】文库Coverage C值为80%,但Rarefaction曲线不够饱和,应加大文库克隆子数目;文库多样性参数香农指数和辛普森指数分别为1.432和0.25,物种丰富度为4.0;以98%为界,30条序列被划分为15个OTU,均
[期刊] 水产学报
[作者]
雷丽娜 高谦 王伟 孙兆盛 罗璋 刘其根
为进一步了解花鲈适应性免疫机制在病害防治中的作用，本研究通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了免疫球蛋白M重链（IgMH）和主要组织兼容性复合体（Major histocompatibility complex class II，MHCII）β基因的全长；通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测它们在花鲈各组织中组织分布情况以及LPS、Poly (I:C) 刺激及迟缓爱德华氏菌人工感染后mRNA水平的表达变化情况；构建了IgMH-pET21d、IgMCH_(1-2)-pET21d和MHCⅡ β-pET21d原核重组表达质粒，进行重组蛋白表达，并通过分子筛层析技术纯化花鲈IgMH、IgMCH_(1-2)和MHCⅡ β重组蛋白，进而制备了抗花鲈IgM的多克隆抗体。结果表明，花鲈IgMH和MHCII β的cDNA全长分别为1 977 bp和1 242 bp；它们在鳃、脾脏和头肾等免疫相关组织中mRNA水平的表达量较高；LPS、Poly (I:C) 刺激及迟缓爱德华氏菌人工感染花鲈导致鳃、脾脏和头肾中这两个基因的表达水平发生显著变化，表明IgMH和MHCII β均参与了花鲈的抗感染免疫反应；此外，抗花鲈IgM的多克隆抗体能与花鲈全血清发生强烈反应，与鳜全血清弱反应，与大口黑鲈和草鱼的不发生反应，推测其反应强度反映了物种间亲缘关系的远近。本研究首次克隆了花鲈的IgMH和MHCⅡ β基因全长，表达了IgMH和MHCⅡ β原核重组蛋白，制备了抗花鲈IgM的多克隆抗体，揭示了IgMH和MHCⅡ β基因参与花鲈的抗感染免疫应答，为深入研究花鲈的免疫调控机制和疾病防控策略奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王辉 张秀清 胡玉红 刘敬兰 孙君社
运用SMART技术成功构建了阔褶水蛙(Hylarana latouchii)皮肤组织全长cDNA文库,用来筛选抗菌肽及其他功能性基因。经鉴定,原始文库滴度为9.7×106cfu/mL,重组率达到91%,插入片段大小在0.3~1.5 kb范围内,文库扩增后的滴度为1.9×109cfu/mL,说明所构建文库质量较高。通过该文库成功筛选出2个抗菌肽cDNA序列,此序列属于brevinin-2家族,因此命名为brevinin-2LT1和brevinin-2LT2。
关键词：
阔褶水蛙 cDNA文库 抗菌肽 文库滴度
[期刊] 水产学报
[作者]
杨丽萍 杨慧荣 张勇 刘云 黄海 刘晓春 蒙子宁 黄俊海 林浩然
以大鲵脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建技术构建了cDNA文库。经检测,文库初始滴度为5.0×105cfu.mL-1,重组率为91.70%,插入片断大小在0.35～3.9kb,平均插入片段大小为0.791kb,文库扩增后滴度为4.0×109cfu.mL-1。随机挑选200个阳性克隆测序,经生物信息学分析,发现20个片段与已报道的基因有较高同源性,包括促甲状腺激素基因、生长激素基因及催乳素基因等,其中三个克隆为促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因。序列分析表明,TSHβcDNA全长序列为705bp,包含417bp开放读码框,编码138个氨基酸序列,其中前19个氨基酸为...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李雯 郭巍 张霞
昆虫围食膜是由几丁质和蛋白质组成一个半透膜结构,由中肠分泌,保护细胞免受机械性损伤和细胞微生物感染。以害虫生物防治的新靶标——中肠围食膜作为研究对象,分离和鉴定甜菜夜蛾中肠围食膜蛋白基因。依据免疫学筛选方法,用制备的甜菜夜蛾围食膜蛋白多克隆抗体,对甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库进行免疫筛选。获得231个围食膜蛋白阳性克隆,经测序、生物信息学分析可知得到8个几丁质结合蛋白,2个肠粘蛋白;并对结构功能进行分析预测。研究结果为揭示围食膜分子结构,进一步以中肠围食膜为靶标进行生物防治奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李杰 张霞 郭巍 刘小民 李新娜 赵丹
昆虫围食膜是保护其中肠的一道物理屏障,破坏围食膜就可能使其中肠处于不正常的生理状态而最终导致死亡。本研究提取棉铃虫Helicoverpa armigera(Hbner)围食膜蛋白,成功制备棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体,并对棉铃虫中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,共得到385个阳性克隆。对其中26个克隆进行鉴定并测序分析,结果表明19个克隆为肠粘蛋白。过碘酸-希夫试剂(PAS)显色法检测棉铃虫围食膜蛋白组成,发现围食膜蛋白大部分为糖蛋白。通过对棉铃虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定,为进一步分析棉铃虫围食膜蛋白的生理功能,寻找生物防治新靶标,开发新型高效生物杀虫剂提供理论依据。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
孙军 梁卉 林小涛 胡云凤 童芳
采用RACE-PCR方法,从鲢(Hypophthalmichthys molitrix)头肾SMARTcDNA中获得了679 bp IL-8 cDNA序列。结果显示:该序列包含169 bp的5′非编码区,213 bp 3′端非编码区和297 bp的开放阅读框;鲢IL-8的开放阅读框编码98个氨基酸残基,其中包含构成两对二硫键的4个保守半胱氨酸。RT-PCR结果显示鲢:IL-8 mRNA主要在胰、肝脏和头肾中表达。将鲢IL-8不含信号肽的成熟多肽克隆到原核融合表达载体pQE30上,转入大肠杆菌M15内进行表达,经SDS-PAGE电泳后显示,重组融合蛋白在分子量约11kD处有一明显表达带,与预期计...
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