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[期刊] 西南农业学报
[作者]
庞耀珊 谢芝勋 谢丽基 谢志勤 邓显文 刘加波 彭宜 范晴
根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg...
关键词：
派琴虫 贝类 LAMP 荧光反应 检测
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤
根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%。该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性。用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%。结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测。
关键词：
派琴虫 PCR 应用
[期刊] 水产学报
[作者]
曲朋 王崇明 任伟成 梁彦韬 贾志磊 黄倢 潘鲁青
奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
吴绍强 李海艳 林祥梅 郑腾 李西峰 刘建 梅琳 韩雪清 贾广乐
选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。
关键词：
派琴虫 贝类 实时荧光PCR 检测
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
车勇良 陈如敬 王隆柏 江斌 吴学敏 刘玉涛 严山 庄向生 周伦江
【目的】建立一种可快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。【方法】根据GenBank中副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白(PalA)基因序列,在其保守区域设计外引物、内引物和环引物用于LAMP检测。优化副猪嗜血杆菌LAMP检测的反应体系,在反应产物中加入SYBR GreenⅠ,对检测结果进行肉眼判定,建立副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,评价该检测方法的特异性、敏感性。用建立的副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法对临床分离的8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测。从疑似患副猪嗜血杆菌病的猪体内采集10种体液,用所建立的可视化LAMP检测方法进行检测。【结果】建立了副猪嗜血杆菌可视化LAMP...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
于劼豪 黄郁葱 孙良娟 钟键 鲁义善 简纪常 蔡双虎
为加强对哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）早期快速诊断，本研究探究建立一种基于环介导等温扩增（LAMP）技术的可视化快速检测方法。基于环二聚体磷酸二酯VieA基因序列在哈维氏弧菌中的保守性，将其作为靶基因设计引物并初步建立LAMP反应体系，对LAMP反应体系中各反应物浓度、内外引物比例、反应时间和反应温度进行优化，并对优化后的LAMP反应的特异性和灵敏度进行检测；分别在优化后的LAMP反应体系中加入SYBR Green I、钙黄绿素-锰离子或羟基萘酚蓝作为指标剂对LAMP反应产物进行可视化判别，从而建立了一种针对哈维氏弧菌的LAMP可视化检测方法。研究表明该LAMP反应体系最佳反应温度60℃、反应时间60 min、Mg~(2+)浓度1.2 mmol·L~(-1)、dNTPs浓度0.64 mmol·L~(-1)、甜菜碱浓度0.25 mmol·L~(-1)及内外引物比例16:1；该反应体系能特异性检测到哈维氏弧菌，且灵敏度为3.4×10~(-6 )ng·μL~(-1)。可视化指标剂钙黄绿素-锰离子的添加比例为12:1或羟基萘酚蓝的添加浓度为390 μmol·L~(-1)时LAMP反应结果的可视化效果最好，临床应用表明该LAMP可视化技术能准确并特异性地检测到珍珠龙胆石斑鱼和凡纳滨对虾组织中感染的哈维氏弧菌。本研究提供了一种简单、快速和结果可视化的哈维氏弧菌LAMP检测方法，可以为水生动物哈维氏弧菌的现场检测和弧菌病的早期诊断提供技术支持。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤
根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测单孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫的检测敏感性达到40拷贝数,比常规PCR敏感性高100倍;对派琴虫、折光马尔太虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果全为阴性。表明该研究建立的单孢子虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床单孢子虫感染的快速检测。
关键词：
贝类 单孢子虫 荧光定量PCR 检测
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘宁宁 易萍 郭爱珍 胡长敏 陈颖钰
为建立一种能够快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）的可视化LAMP检测法，利用LAMP引物设计软件，以溶血性曼氏杆菌保守基因lktC序列设计内引物、外引物及环引物，对其反应温度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度等条件进行优化，并检测了方法的敏感性、特异性及实用性。结果显示，该方法在68.2℃、6 mmol/L Mg~(2+)、1.6 mmol/L dNTPs条件下达到最佳，40 min内完成检测并可通过肉眼判定结果，对细菌的最低检测限为6.7×10~(-1) cfu/μL，对lktC重组质粒的最低检测限为7.9×10~2 copies/μL，敏感性高；与15种病原均不发生交叉反应，特异性好；对背景清晰小鼠肺组织样本检测结果显示该方法实用性良好，且优于普通PCR方法。表明该方法可快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赖多 王德林 邵雪花 秦健 庄庆礼 肖维强
【目的】建立余甘子果实斑点病菌快速、便捷、灵敏、可视的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法,为该病害的风险预判和科学防治提供依据。【方法】以余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌（Diaporthe phoenicicola）的翻译延伸因子EF-1α基因为靶序列,设计LAMP特异性扩增引物;以余甘子间座壳菌DNA为模板,优化反应温度、反应时间、d NTPs浓度、Mg2+浓度和内外侧引物浓度比,建立LAMP检测最佳反应体系,测试其特异性和灵敏性,并对余甘子发病果实进行实际检测。【结果】适用于余甘子果实斑点病LAMP检测的最佳引物为引物组合4（EF4-F3/EF4-B3和EF4-FIP/EF4-BIP）;LAMP检测最佳反应条件为d NTPs浓度1.0 mmol/L,Mg2+浓度4 mmol/L,内外侧引物质量比6∶1,反应温度63℃,反应时间50 min。优化后的LAMP检测方法可特异性地检出余甘子间座壳菌（D. phoenicicola）,检测灵敏度可达0.01 ng/μL,且在实际应用中准确率高达100%。【结论】首次建立了余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌LAMP可视化快速检测方法,该方法特异性强、灵敏度高,操作简单,可用于田间余甘子果实斑点病菌的快速检测。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤
根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。结果显示研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。
关键词：
贝类 折光马尔太虫 荧光定量PCR
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李彬 杜露平 何孔旺 孙冰 倪艳秀 温立斌 张雪寒
为提高猪Hokovirus(PHoV)检测的敏感性和简便性,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种敏感、特异、快速、简便、实用的检测PHoV的技术。针对PHoV VP1/2基因保守区设计4条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化并检测其敏感性和特异性。结果表明,所建立的方法最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃,该方法具有良好的特异性,与其它常见动物病毒(PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、PPV、JEV)无交叉反应,对PHoV的最低检出量为10拷贝,其敏感性是PCR方法的10倍,且通过加入荧光染料可直接判定结果。研究表明,该方法特异性强、敏感性高,且操作简便、检测...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘帅帅 姚琳 马丽萍 周德庆 赵峰
人类组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)是诺如病毒(NoVs)的结合受体,本研究假设贝类中也存在类似的HBGAs并且特异性地富集NoVs,利用HBGAs单克隆抗体,建立贝类中3种HBGAs的ELISA检测方法,分析牡蛎(Crassostrea gigas)、缢蛏(Sinonovacula constricta)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)等6种双壳贝类中HBGAs...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张枭 李绍戊 王荻 曹永生 卢彤岩
鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是导致虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肠炎红嘴病的病原。本研究以鲁氏耶尔森菌毒力因子rup A基因为靶标设计1对特异性引物,以含有rup A基因部分序列的重组质粒为标准品构建标准曲线,优化建立检测鲁氏耶尔森菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对腹腔注射鲁氏耶尔森菌菌悬液的虹鳟肝、肾、脾、血液样品进行检测。结果显示,设计的引物具有良好的种间特异性,标准曲线线性方程为y=–3.3766x+40.012(R2=0.9958);最
[期刊] 淡水渔业
[作者]
谷庆花 李铭远 司鑫鑫 高嵩
本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips, LFS)相结合的可视化快速检测杀鲑气单胞菌的方法。结果显示:本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法在37℃孵育25 min即可完成,特异性良好,与其他致病菌无交叉反应;灵敏度实验结果显示,该菌的纯培养物和人工污染的鲤鱼组织中的最低检测限均为单次反应1 CFU(colony forming unit)。本研究建立的基于RPA-LFS的杀鲑气单胞菌检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,检测结果可通过肉眼直接观察,操作简单,不依赖昂贵的仪器设备,适用于养殖业中杀鲑气单胞菌的现场检测。
[期刊] 水产学报
[作者]
谷莉 郑玉东 张翔 白昌明 刘金兰 辛鲁生 李晨 王崇明
为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布，明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程，实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点，病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化，实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增，筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件，最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示，HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节，48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号，分布局限于外周神经中。在感染实验后期，病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润，渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检测方法，同步实现了高灵敏度和精确定位的功能。该检测方法适用于病毒感染的确诊、不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。
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