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[期刊] 西南农业学报
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤
根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测单孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫的检测敏感性达到40拷贝数,比常规PCR敏感性高100倍;对派琴虫、折光马尔太虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果全为阴性。表明该研究建立的单孢子虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床单孢子虫感染的快速检测。
关键词：
贝类 单孢子虫 荧光定量PCR 检测
[期刊] 西南农业学报
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤
根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。结果显示研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。
关键词：
贝类 折光马尔太虫 荧光定量PCR
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
吴绍强 李海艳 林祥梅 郑腾 李西峰 刘建 梅琳 韩雪清 贾广乐
选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。
关键词：
派琴虫 贝类 实时荧光PCR 检测
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤
根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤
根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%。该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性。用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%。结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测。
关键词：
派琴虫 PCR 应用
[期刊] 水产学报
[作者]
曹泽艺 周庆杰 陈凯 习丙文 谢骏 潘良坤 毛颖
为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
扈鸿霞 马宇轩 王艳红 林峻 李占武 季荣
【目的】建立一种灵敏、快捷的检测蝗虫微孢子虫（Ｐａｒａｎｏｓｅｍａ ｌｏｃｕｓｔａｅ）的套式Ｐｃｒ方法，为运用微孢子虫防治蝗虫提供技术支持。【方法】以ＧｅｎＢａｎｋ数据库中公布的保守性高的微孢子虫小核糖体亚单位ｒｎａ为目的基因，采用Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ软件设计两对特异的套式Ｐｃｒ引物Ｐ．ｌ．－Ｆ１／Ｐ．ｌ．－ｒ１和Ｐ．ｌ．－Ｆ２／Ｐ．ｌ．－ｒ２，将微孢子虫液用０．２ ｍｏｌ·ｌ～（－１） ｋｏＨ处理后得到的发芽液作为模板进行Ｐｃｒ扩增，建立以Ｐ．ｌ．－Ｆ１／Ｐ．ｌ．－ｒ１为外侧引物、Ｐ．ｌ．－Ｆ２／Ｐ．ｌ．－ｒ２为内侧引物的套式Ｐｃｒ，扩增产为分别为２９８和２４２ ＢＰ。对引物浓度、退火温．．．
关键词：
蝗虫微孢子虫 套式PCR 检测
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘珍 张庆利 万晓媛 马芳 黄倢
根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中公布的虾肝肠胞虫（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ）（ｅｈｐ）ＳＳＵ ｒ Ｄｎａ序列设计１对特异性引物，建立并优化了ｅｈｐ的ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎ ｉ实时荧光定量ｐｃｒ（ｑ ｐｃｒ）检测方法。结果显示，该方法在６０℃的退火温度时扩增效果最好，产物的熔解曲线为１个单峰，构建的方法对８．３×１０１–８．３×１０８ ｃｏｐｉｅＳ／μｌ的ｅｈｐ ＳＳＵ ｒ Ｄｎａ片段的检测响应具有良好的线性关系，扩增产物阈值循环数（ｃｔ）与模板起始量的对数［ｌｏＧ（Ｓｑ）］的关系为ｃｔ＝–３．３６９ ｌｏＧ（Ｓｑ）＋３９．３６４（ｒ２＝０．９９２），扩增效率为９８．１％，检测．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵玮琦 何朋杰 吴毅歆 何月秋
【目的】十字花科作物根肿病是一种世界性病害,早期准确定量检测病原是实现有效防控的基础,研究旨在建立一种应用于水体中检测根肿菌的实时荧光定量PCR方法。【方法】采用近年已研究并发表的一对引物。建立并优化RT-PCR反应体系,利用大肠杆菌TG-1、大肠杆菌T1-1、大肠杆菌DH5α、肺炎克雷伯菌E3、枯草芽孢杆菌XF-1、解淀粉芽孢杆菌Y2、柑橘黄龙病病原菌、假单胞菌E12、成团泛菌L9、阴沟肠杆菌C6、荧光假单胞菌df等11种病原物进行RT-PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测不同接种浓度的水体中的根肿菌。【结果】得出标准曲线的回归方程为Y=-3. 452X+35. 118,其回归系数R2=0. 996,扩增曲线在1×101～1×107拷贝/μl范围内,具有较好的线性关系,扩增效率94. 833%,相邻扩增曲线间距均匀,1×101拷贝/μl为最低检测值。熔解曲线显示,所有产物具有单一峰形,有高度扩增特异性。重复性试验变异系数小于1%。在人工接种的水体中,检测下限至少为102个孢子/m L。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法具有快速、特异、敏感和稳定等优点,为检测根肿菌在水体中的含量提供了技术方法。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
肖淑敏 李国清 李韦华 周荣琼 杨建伟
【目的】建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列,设计1对保守引物和1对特异性引物,建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件,进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段,与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到2.85×10-2fg的阳性参照DNA;对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性,有较好的临...
关键词：
环孢子虫 奶牛 套式PCR 检测
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱娜 陈国强 张敬友 范红结
根据GenBank发表的猴痘病毒(AF380138)F3L基因全序列,设计并合成了引物和TaqMan、MGB探针,建立了F3L基因的荧光定量PCR检测方法。应用该方法可从人工合成的猴痘病毒F3L基因片段(48 048～48 509 bp)扩增典型的"S"型曲线,25μL反应体系检测灵敏度可达6.8拷贝,但不能从鸡痘、山羊痘等病毒中扩增出相应的扩增曲线。结论:本方法可快速、敏感、特异地检测猴痘病毒。
关键词：
猴痘病毒 荧光定量PCR 检测
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵丽 赵绪永 陈红英 崔保安
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周云雷 魏飞龙 李健 张小华 蒋红霞
【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈利达 袁军海 李磊 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚
为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。
关键词：
镰孢菌 实时荧光定量PCR 湿度 病残体
[期刊] 华北农学报
[作者]
李碧侠 赵芳 任守文 王学敏 方晓敏
SIRT1基因对细胞的生存、衰老、凋亡等生理活动起着十分重要的调节作用。为了建立荧光定量PCR技术检测猪SIRT1基因表达量,根据GenBank中猪SIRT1 mRNA序列设计引物,建立基于SYBR Green I染料技术的荧光定量PCR检测方法。结果表明,所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感和特异性强等特点,为猪SIRT1基因定量分析提供了技术平台。
关键词：
猪 SIRT1 荧光定量PCR
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