植物肌动蛋白在植物顶端生长、细胞分裂分化和细胞信号转导等多种生命活动中发挥着重要作用。豌豆中存在多种肌动蛋白异型体。研究豌豆肌动蛋白异型体PEAc3与组氨酸标签(His-tag)及绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达,并分析了融合蛋白的聚合特性。采用RT-PCR的方法克隆PEAc3基因,构建原核表达载体pET30 a-His-PEAc3-GFP。用DNAman生物学软件分析表明,PEAc3融合蛋白全长675个氨基酸,分子量74.74 ku,等电点5.81。将pET30 a-His-PEAc3-GFP转入大肠杆菌BL21中,优化的诱导表达条件为:25℃,当菌液OD600达到0.8时加入IPTG(浓度...

以培养3～4 d的豌豆幼苗为试验材料,以18S rRNA基因为内参基因,豌豆幼肌动蛋白异型体PEAcII基因为检测基因,在PEG6000模拟水分亏缺条件下,采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)体系检测肌动蛋白异型体PEAcII基因在豌豆幼苗中的表达情况。在正常供水条件下,PEAcII在处理的第8 h表达量最高,水分胁迫下,PEA-cII基因在处理的0.5 h表达量下降,在处理的1 h时表达量最高,而后下降。无论是正常供水还是水分胁迫条件下,PEAcII基因的表达都是一个动态变化的过程。试验结果表明,肌动蛋白异型体PEAcII表达量的高低可能与豌豆幼苗适应水分亏缺的生理过程有关,这对于...

高等植物细胞内含有肌动蛋白 ,但含量较低 ,难于提取及进行进一步研究。我们用 PCR的方法扩增肌动蛋白 c DNA,并克隆到表达质粒 p Trp His,然后转化大肠杆菌 DH5α;在 IPTG诱导下 ,肌动蛋白表达在包涵体中 ,在没有 IPTG诱导时 ,肌动蛋白表达在胞液中

从豌豆幼苗及开花植株各器官提取总RNA，以豌豆肌动蛋白基因（PEAC1）为探针，鉴定肌动蛋白基因在不同器官的表达。Northern和Dotblot结果表明，肌动蛋白基因在豌豆中的表达具有发育阶段特异性，它倾向于在豌豆5天苗的芽和2天苗的报中特异表达。

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物...

为探讨蓖麻肌动蛋白(Actin)基因(RcActin)是否可作为蓖麻基因表达研究中的内参基因。以蓖麻生长根为试验材料,根据GenBank中公布的RcActin全长cDNA序列(登录号:XM_002522148.3)设计合成特异性引物,经PCR扩增获得RcActin的编码序列(CDS),并将其插入原核表达载体pET32a(+)中。重组表达载体pET32a(+)-RcActin转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合6个组氨酸标签的目的蛋白,表达蛋白经钴离子螯合磁珠纯化后,采用Western Blot验证,结果表明,pET32a(+)-RcActin可诱导表达分子量约为61.46 ku的融合蛋白His-RcActin。用纯化的His-RcActin免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选获得9株能分泌抗蓖麻RcActin蛋白质单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)的杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株刺激小鼠,取腹水,采用间接ELISA方法测定,结果表明,5株阳性单克隆细胞株腹水效价达到1∶1 000 000及以上。用蛋白A/G亲和层析法纯化His-RcActin McAb;采用间接ELISA方法对纯化McAb的特异性进行测定,3株阳性细胞株能分泌针对RcActin的特异性McAb;通过抗体亚类鉴定试剂盒鉴定纯化McAb的亚型,结果表明,3株阳性细胞株分泌的McAb亚类均为IgG1。采用间接ELISA方法对3株阳性细胞株分泌McAb的稳定性进行鉴定,获得1株在体外传19代或液氮冻存4个月后、能稳定分泌McAb的阳性细胞株。采用Western Blot和间接ELISA方法对从该细胞株中纯化的McAb的特异性、效价进行验证,结果表明,获得的McAb具有针对RcActin的特异性且效价为1∶512 000。以制备的McAb为一抗,利用Western Blot方法分析RcActin在正常水肥管理且时空一致条件下的蓖麻8个组织中的表达量,结果表明,蓖麻不同组织中RcActin的含量存在显著性差异(P<0.05)。RcActin表达研究为蓖麻功能基因表达分析中内参基因的筛选提供了一定的理论依据。

为探寻肌动蛋白解聚因子（ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｄｆ）在调控肌动蛋白解聚和聚合平衡过程中发挥的作用，从橡胶树中获得了Ｈｂ ａｄｆ基因组序列，经测定，该序列长２ ２５８ ｂｐ，含有２个内含子和３个外显子，在裂殖酵母中过表达Ｈｂ ａｄｆ，获得相对分子质量约３８ ０００的融合蛋白。对裂殖酵母细胞形态进行观察，发现诱导表达Ｈｂ ａｄｆ的酵母细胞长度显著增加，双核和多核比例达６７％。实时荧光定量ｐｃｒ结果表明，Ｈｂ ａｄｆ的表达受３％Ｋｉ处理调控，在橡胶树不同死皮阶段和不同排胶时间段的表达存在变化，说明Ｈｂ ａｄｆ可能参与了橡胶树排胶和死皮的过程。

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1483bp,由长92bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257bp的3′非翻译区,和1134bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异...

【目的】研究樟叶越桔肌动蛋白Actin7基因的组织表达特征。【方法】在樟叶越桔三代转录组数据库的基础上，应用PCR技术成功克隆VdActin7基因cDNA和DNA序列。进一步利用qRT-PCR技术检测并分析VdActin7基因在樟叶越桔幼嫩叶片、成熟叶片、花芽、花、绿色果实、红色果实、绿色果梗和红色果梗等组织中的表达情况。【结果】获得VdActin7基因DNA序列1657 bp, cDNA序列1387 bp。VdActin7基因含有3个内含子，分别为93 bp的intron1、89 bp的intron2和88 bp的intron3,完整开放阅读框长1134 bp,编码377个氨基酸，理论分子量为41.70 KD,等电点为5.31,无信号肽和跨膜结构，属于稳定亲水性蛋白。系统进化树分析发现，VdActin7蛋白与同为越橘属的兔眼越橘(Vaccinium ashei)Actin7亲缘关系最近。VdActin7基因密码子偏好性分析显示，总GC含量和同义密码子第三位核苷酸含量(GC3s)分别为48.2%和44.1%,有效密码子数(ENC)为49.28%,高频密码子共有31个。VdActin7与枣树(Ziziphus jujuba)ZjActin7基因相似，均对CUU偏好性最强，GUU次之，但VdActin对CUU的偏好性(3.43)明显强于ZjActin7(2.57)。qRT-PCR结果显示，VdActin7基因表达呈现明显的组织特异性，在嫩叶中高表达，在成熟叶和果梗中表达量较低，而在果实中检测不到表达量或不表达，暗示VdActin7基因可能在嫩叶的发育过程中发挥重要作用。【结论】本文首次报道了樟叶越桔Actin7基因序列及序列特征，并发现VdActin7基因具有组织表达特异性，为进一步研究VdActin7基因功能、表达调控及作用机制奠定了基础。

【目的】获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因序列,探讨其作为内参基因的可行性。【方法】通过比对其他昆虫β-肌动蛋白的氨基酸序列设计简并引物,用PCR的方法获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR和qRT-PCR的方法,研究β-肌动蛋白基因在华山松大小蠹不同发育阶段和成虫不同组织的表达情况。【结果】获得了1 461bp的华山松大小蠹β-肌动蛋白基因cDNA序列,与其他昆虫肌动蛋白基因核苷酸序列的相似性在86%以上,且该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹、成虫3个发育阶段以及成虫的头、胸、腹、足、翅等组织中表达稳定,且表达量无明显差异。【结论】成功获得了华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,且...

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进...

采用RT-PCR和RACE法,从黄鳝(MonopterusalbusZuieuw)肝脏中分离和克隆黄鳝β-肌动蛋白(actin)基因。该基因cDNA全长1765bp[不包括poly(A)],5'端非翻译区12bp,3'端非翻译区有625bp[不包含poly(A)],阅读框(Openreadingframe,ORF)1128bp,翻译成375个氨基酸,蛋白质分子量41 77kD。将所得序列与各科鱼、蛙、鸡、牛、鼠、人等的β-肌动蛋白基因序列同源性分析显示,核苷酸序列具有68%～95%的相似性,氨基酸序列具有97%～100%相似性,显示该基因在生物进化过程中的保守;系统发育分析表明黄鳝β-肌动蛋白...

【目的】克隆桑树肌动蛋白MaACT3的启动子。【方法】采用抑制PCR技术获得肌动蛋白的5′端侧翼序列;采用农杆菌感染成熟叶片瞬时表达检测启动子活性。【结果】获得的5′端侧翼序列含有基因的翻译起始位点、第一外显子、第一内含子和第二外显子的一部分,外显子部分与已报道的桑树肌动蛋白MaACT3序列完全相同。通过荧光显微镜观察到了绿色荧光,在mRNA水平上也检测到表达,证实了获得的5′端序列具有启动活性。【结论】获得的桑树肌动蛋白MaACT3的启动子具有启动活性,可以应用于桑树转基因研究。

通过锚定的 3′ RACE筛选实验 ,确定锚定效率最好的下游引物 ,用于褐飞虱各发育期肌动蛋白基因表达的RT PCR检测。结果表明 :3个锚定引物中 ,0 4 2 2 7( 5′ >TCACACAGGAAACAGCTATGACTTTTTTTTTTTTTTA

食物过敏是人类常见的一种过敏性疾病,主要由食物中的蛋白质引起。原肌球蛋白(tropomyosin,TPM)是食用虾蟹等甲壳动物引起过敏反应的主要致敏物质。研究从日本囊对虾肌肉组织中克隆了TPM基因,进行了原核表达和蛋白质纯化,并进一步制备了相应的抗体。Western-blotting分析表明原肌球蛋白在日本囊对虾组织中普遍表达,并且肌肉组织中表达量最高而鳃和皮肤组织中表达量最低。研究结果为对虾过敏性疾病的诊断和治疗以及脱敏食品开发等奠定了理论基础。