为了快速检测谷子种子携带线虫情况并了解不同地区线虫种群的多态性,利用PCR技术对采集自中国谷子主产区不同区域内的99份谷子种子的带线虫情况进行了检测,并分析其不同地区线虫种群的遗传多样性。结果表明,根据贝西滑刃线虫核糖体28S rRNA-D2/D3片段设计的引物对谷子线虫具有高度的特异性和灵敏性,扩增出245 bp的特异性目的片段,对谷子线虫的检测浓度最低为0. 125 ng/μL。在99份谷子种子DNA中,有33份种子检测到特异性扩增条带,测序结果表明,所有扩增条带对应序列与线虫28S rRNA序列的相似性达97%以上,进一步说明33份种子携带线虫。重复试验结果表明,阳性种子的带线虫频率介于33. 3%～100%,且带线虫的谷子种子主要来自春谷区。分析33份阳性样品的28S rRNA片段序列,存在29个变异位点和22种单倍型,其中单倍型AB1为优势单倍型,河北张家口市和内蒙古松山区两地线虫的单倍型遗传多样性最丰富。本研究建立了一种特异性好、灵敏度高的检测谷子种子带线虫的一步PCR方法;谷子线虫病是夏谷区的主要病害,随着谷子春夏谷区的交流,线虫病成为春谷区病害,种子带病可能是主要初侵染源;不同地理来源的线虫28S rRNA序列存在差异,AB1为优势单倍型。

将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5'-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3'),反向引物为M05R1(5'-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3'),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行...

【目的】从日本五针松(Pinus parviflora)栽培圃地调查松褐天牛(Monochumus alternatus),并取样镜检松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus),揭示日本五针松感染松材线虫病的可能性和扩散风险,为开展检疫提供理论依据。【方法】在日本五针松圃地采集枯死或濒死的日本五针松植株,采用分离镜检法检测枯死或濒死日本五针松木质部的线虫种类;剖木检查天牛危害,观察留在日本五针松松枝上的补充营养伤口,同时鉴定天牛幼虫特征,解剖检验羽化的天牛成虫携带LⅣ状态。【结果】在

【目的】通过在海南省乐东县、河南省洛阳市、吉林省吉林市和公主岭市4个不同地理环境调查谷子10个主要性状,进行SSR标记与性状的关联分析,获得单一环境特异表达位点及多个环境共同表达位点,发掘优异等位变异,探究谷子可能的生态适应性形成机制,为开展谷子分子辅助选择育种奠定基础。【方法】连续2年在吉林省吉林市和公主岭市、河南省洛阳市、海南省乐东县调查102份谷子资源株高、穗长、叶片数、穗粗、抽穗期、穗码数、码粒数、穗重、穗粒重、千粒重10个主要农艺性状的基础上,首先利用SPSS19.0软件对每个地理环境进行性状间相关性分析,再用70个多态性SSR标记对谷子资源进行基因型鉴定,分析102份谷子资源的遗传多样性和群体遗传结构,最后用TASSEL5.0软件进行标记间的连锁不平衡分析,并用GLM和MLM 2种模型开展分子标记与表型性状的关联分析。【结果】除了千粒重,其余9个性状间在4个地理环境普遍存在显著或极显著正相关,千粒重只在在吉林市、公主岭市、洛阳市3个环境与穗粒重、株高、穗长、穗重呈显著或极显著正相关,在海南乐东县与其他9个性状没有显著相关性;70对SSR引物共检测到397个等位基因,平均每个标记的观测等位基因数、有效等位基因数、期望杂合度、Shannon指数分别为6、2.24、0.4637、0.7738;遗传多样性和群体结构分析均将102份谷子材料分为4个群,来自河南的谷子材料散布在4个群中,表现较丰富的遗传多样性;70对SSR标记间连锁不平衡分析未发现明显的连锁不平衡结构;GLM、MLM 2种模型共检测到10个关联标记,结合等位效应分析确定b115、MPGC13、b227、b194、p56在吉林市、公主岭市2个环境与穗重、穗长、叶片数、抽穗期4个性状关联,sigms9034、b125在洛阳市与穗长、穗码数关联,P18和p59在乐东县与穗重关联,p6在吉林市、公主岭市和洛阳市分别与叶片数和穗码数关联,单个标记对表型变异的平均贡献率在7.76%—34.05%;3个标记等位基因sigms9034-168、P18-166、p56-244分别能够显著增加穗长、穗重,缩短抽穗期。【结论】连续2年获得了5个在吉林市、公主岭市稳定表达的标记位点b115、MPGC13、b227、b194和p56,2个在洛阳市稳定表达的标记位点sigms9034、b125,2个在乐东县稳定表达的位点P18和p59,1个在洛阳市和吉林市、公主岭市同时稳定表达的标记位点p6;获得了3个可用于穗部性状、生育期标记辅助选择的优异等位基因sigms9034(168 bp)、P18(166bp)、p56(244 bp)。

为检验已开发的SCAR标记与实时PCR两种分子检测方法鉴定松材线虫的可靠性,本文选用线虫未知种样品7个以及已知种样品3个为实验材料,采用上述两种分子检测方法进行检测,并且对7个线虫未知种样品进行形态鉴定。结果表明:1)运用SCAR标记检测,第2、3、4、7号4个未知种样品与8号松材线虫样品出现了一条清晰、明亮的860bp特异条带,第1、5、6号样品与9号拟松材线虫、10号大核滑刃线虫均未出现扩增谱带,表明第2、3、4、7号4个待测样品中含有松材线虫,而第1、5、6号3个待测样品中不含有松材线虫;2)运用实时PCR检测,第2、3、4、7号4个样品与8号松材线虫样品表现有明显的阳性扩增信号,其余样...

从福建省闽南地区的胡萝卜、辣椒和空心菜根系发现一种线虫,通过形态鉴定,结合ITS1-5.8S-ITS2 r DNA区、28S D2-D3区、COⅡ/IrRNA线粒体基因和线粒体DNA 63 bp重复区序列分析等分子生物学方法,将其鉴定为象耳豆根结线虫;采用特异性引物Me-F/Me-R对不同田块的象耳豆根结线虫种群进行进一步检测,结果表明,空心菜为象耳豆根结线虫的新寄主;受侵染的番石榴可能是闽南地区蔬菜象耳豆根结线虫病的重要初侵染源.由此说明,象耳豆根结线虫已经成为福建省蔬菜上的重要病原物,对蔬菜产业发展具

松材线虫Bursaphelenchusxylophilus早期诊断是防治松材线虫病的重要环节。为了在早期快速测定寄主(松树)体内的病原线虫,开发了便携式显微镜和松枝解剖技术。用修枝剪采集松枝,用解剖刀进行松枝切片,再用便携式显微镜镜检,结果显示松枝内松材线虫检出率为70%,其中濒死松树内检出率为100%,局部枯枝内检出率为60%,健康枝内检出率为0。野外松林内鉴定一个样本平均用时2.5min。使携式显微镜加枝条解剖法能对松材线虫病实施早期快速诊断。表3参25

【目的】玉米孢囊线虫（Heterodera zeae）为孢囊线虫属定居型半内寄生线虫，可侵染多种禾本科作物的根部，玉米孢囊线虫的发生和传播扩散将会对我国玉米生产造成严重威胁。本研究旨在建立玉米孢囊线虫的快速分子检测体系，以期从近缘属种可以准确地检测出玉米孢囊线虫，为玉米孢囊线虫的监测预警和防控打下技术基础。【方法】从我国河南、河北、甘肃、山东、湖南、广西和北京共收集20个玉米孢囊线虫近缘属种群体作为供试线虫；选取13条含有10个碱基的随机引物，采用RPAD技术对供试孢囊线虫进行多态性分析，筛出玉米孢囊线虫特异性RPAD片段，并将其转化为玉米孢囊线虫SCAR-PCR引物；采用PCR方法测试玉米孢囊线虫特异性引物的准确性以及检测技术体系的稳定性、灵敏度和实效性。【结果】通过RAPD比对分析，发现随机引物OPA03能在玉米孢囊线虫基因组DNA中扩增出一条468 bp的特异性片段；将该片段回收测序，根据片段序列信息，利用Primer 5.0设计一对特异性引物HzF1/HzR1；特异性检测结果表明，HzF1/HzR1仅在玉米孢囊线虫群体中扩增出大小为393 bp的特异性片段，其他5种16个孢囊群体（禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫）和4个其他种群（水稻干尖线虫、马铃薯腐烂茎线虫、落选短体线虫和咖啡短体线虫）均没有扩增出目的条带；以含有玉米孢囊线虫的混合种群孢囊DNA为模板时，特异性引物HzF1/HzR1也能扩增出来单一明亮的393 bp的特异片段，而不含玉米孢囊线虫的混合种群不能扩增出该片段；该体系实现了玉米孢囊线虫准确、稳定的检测目的；对建立的玉米孢囊线虫快速检测技术体系灵敏度和实用范围测试，表明该检测体系对玉米孢囊线虫单个孢囊和单条幼虫均有灵敏的检测能力，检出值不低于1/2 000个孢囊和1/80条2龄幼虫。【结论】本研究建立的玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术，可用于玉米孢囊线虫单一样本和混合种群的快速检测，对玉米孢囊线虫的孢囊和2龄幼虫均有灵敏的检测能力，检测引物特异性强，检测方法便捷稳定，灵敏度高。

根据旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)和常见孢囊线虫的ITS序列比对分析,设计1对旱稻孢囊线虫特异性引物He–F/He–R,特异性片段长度为281 bp。运用该特异性引物及建立的DNA提取方法和PCR体系,可特异性检测旱稻孢囊线虫单条2龄幼虫,可以从混合有1条旱稻孢囊线虫的0.1 g水稻根组织中特异性检测出目的DNA片段。特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合,运用一步双重PCR检测方法可快速鉴定单孢囊,也可从初始分离的田间土壤总线虫样品中直接检测出旱稻孢囊线虫。

利用本研究筛选出的一对松材线虫特异性PCR引物(上游引物:5′-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3′,下游引物:5′-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3′),从松材线虫DNA中,扩增出一条长度403bp(基因库登陆号:DQ855275)的特异性DNA片段。该引物可以将松材线虫DNA与松墨天牛组织以及拟松材线虫、畸刺伞滑刃线虫、变异伞滑刃线虫、小角伞滑刃线虫、利昂伞滑刃线虫、湖南伞滑刃线虫、红松滑刃线虫、滑刃属线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、剑尾齿杆双胃线虫和寄生小杆属线虫等12种线虫的DNA区分开来。在此基础上,建立一套利用PCR技术直接从受感染的松墨天牛组织中检测出...

为了获取准确、快速检测松材线虫的方法,利用纤维素酶活性、苯乙酸与苯甲酸含量和显色剂检测松材线虫的方法进行了比较研究.纤维素酶活性检测结果为病树与健树酶活性差异显著.病树的光吸收值与健树的光吸收值差异不显著,但测定结果不稳定.显色剂测定病树内与健树内的显色差异明显,病树的显色结果呈深红色至浅红色,线虫愈多色泽愈深;健康材呈无色,感染拟松材线虫的松材呈清白色或无色.显色剂检测是简单、快速和有应用价值的方法.

为了检测进口球根花卉种球携带的线虫,尤其是检疫名录之外的植物线虫,本研究首次采用本实验室设计的线虫7 d自然游离分离法对进口花卉种球所携带的线虫进行了数量检测和营养类群归类。结果表明:1)从荷兰和新西兰进口的百合、郁金香等6种花卉种球中检出的线虫共涉及3目10科12属,其中非植物线虫分属1目3科4属,检疫名录以外的植物线虫数量占前3位的属有拟滑刃属(Aphelenchoides)、滑刃属(Aphelenchus)和短体属(Pratylenchus),分别占植物线虫总数的77.1%、16.4%和2.9%;2)新西兰进口百合种球中检测出的拟滑刃属线虫数量(426条/10球)为荷兰进口品种的3.5倍...

运用PCR技术,实现了对相似穿孔线虫单条虫ITS区域的扩增,通过基因测序以及与GenBank中rDNA序列的比较,结果显示GFCh、HANh、GZll和GZlbs 4个种群的序列与GenBank中Radopholus similisThrone序列具有高度同源性。聚类分析表明,这4个种群可能有着不同的地理来源。

以松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清 ,通过免疫印迹考察抗血清的特异性。利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争 ,建立竞争型ELISA法用于疫木中松材线虫的分析。该方法可以直接检测出 10mg的木屑中 0 1μg微量的线虫蛋白 ,约 7条线虫的存在。利用该方法对 2 0个不同地区、树种及类型的松材样品进行检测 ,疫木中松材线虫的检出率为 10 0 % ,但拟松材线虫也呈现了一定的交叉反应。研究结果表明 ,以松材线虫抗原蛋白为指标的免疫学检测方法简便快速、灵敏度高 ,为松材线虫的快速检疫提供一种可能的途径

通过对rDNA的ITS区和IGS2区进行PCR扩增并对产物测序,比较分析了西班牙根结线虫与中国4种常见的南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫群体rDNA的ITS区和IGS2区的序列差异,选择限制性内切酶TaqⅠ对IGS2区的PCR扩增产物进行酶切,获得了西班牙根结线虫的554 bp的特异性条带。表明用此方法可以明显将西班牙根结线虫与其他4种常见的根结线虫群体区分开,其灵敏度可达到单条根结线虫二龄幼虫。