【背景】解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）是仁果类果树火疫病的病原体，对全球苹果和梨的生产构成严重威胁。随着抗生素耐药菌株的出现，火疫病的防治面临巨大的挑战。【目的】分离一种新的裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，并分析该噬菌体裂解相关基因的功能，为火疫病的防治提供新的选择。【方法】以解淀粉欧文氏菌Ea102为宿主菌，采用双层平板法从流行火疫病的果园土壤中分离噬菌体。通过噬菌斑和透射电镜观察其形态。用PacBio测序技术测定噬菌体基因组，SPAdes组装序列，RAST注释基因组。通过大肠杆菌原核表达系统分析噬菌体Kuerle的裂解机制。【结果】分离纯化出一株裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，命名为Kuerle。Kuerle由二十面体衣壳的头部和短尾组成，潜伏期约为50 min，裂解量约为240 pfu/cell。噬菌体基因组全长75 599 bp,GC含量48.0%，末端有393 bp的重复序列，未发现与溶原调控相关的基因。共预测到85个开放阅读框（open reading frame,ORF），其中33个已知功能蛋白中包含一个由3 550 aa组成的巨大病毒颗粒相关的RNA聚合酶（virion-associated RNA polymerase,vRNAP），该vRNAP是Schitoviridae科噬菌体的主要特征之一。病毒粒子和基因结构表明噬菌体Kuerle属于有尾噬菌体类的Schitoviridae科病毒。聚集在DNA晚期表达区的3个裂解相关基因holin、endolysin和spanin组成了“裂解盒”。在大肠杆菌中Kuerle-holin的表达会抑制细胞的生长，而Kuerle-endolysin的表达可裂解细胞。二者共表达时Kuerle-holin会加速Kuerle-endolysin引起的细胞裂解。用叠氮化钠抑制细菌的一般分泌系统（Sec）或Kuerle-endolysin N端信号序列的缺失均会导致endolysin裂解功能丧失。上述结果表明噬菌体Kuerle具有pinholin-SAR endolysin裂解系统。Kuerle-holin(pinholin)使细胞质膜去极化以激活分泌的Kuerle-endolysin(SAR endolysin)降解肽聚糖层。【结论】Kuerle是一株烈性噬菌体并且Kuerle-endolysin抑菌效果显著，为后续火疫病生防试剂的制备提供了理论依据和研究材料。

为了获得广谱噬菌体裂解酶,根据裂解酶结构及种属特异性,将金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶Ply187CHAP及酶K的SH3b重新合成,并同时将末端引入单核细胞增生性李斯特菌噬菌体裂解酶LysZ5结合结构域,构建具有能够裂解金黄色葡萄球菌及李斯特菌的多功能裂解酶。SDS-PAGE结果表明,融合结构域的重构酶蛋白Ply187KS-Z5大小约为58 kDa,其在金黄色葡萄球菌及李斯特菌平板表面能够形成透明裂解圈。分析对金黄色葡萄球菌及李斯特菌在生肉表面的裂解活性表明,嵌合酶蛋白Ply187-KS能够有效裂解金黄色葡萄

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;...

为研究耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗方法，本研究以耐黏菌素大肠杆菌为宿主菌，采用双层琼脂平板法从山东烟台某养鸡场污水样中分离纯化得到裂解性噬菌体SDYTW1-F1-2-2。通过透射电镜观察，最佳感染复数，一步生长曲线，温度稳定性，酸碱度稳定性等生物学特性测定，并对其进行全基因组测序分析。结果表明：1）噬菌体SDYTW1-F1-2-2噬菌斑呈现透亮，外周无晕圈，形态学观察显示其具有可伸缩性尾鞘。2）生物学特性分析表明，噬菌体最佳感染复数为0.1，潜伏期为50 min，爆发期为40 min，爆发量为（331±9）PFU/cell。在温度4～40℃，pH为4～12的环境下，噬菌体活性较为稳定。3）通过噬菌体全基因组测序及核酸类型鉴定显示，该噬菌体基因组全长为74 752 bp，双链DNA,GC含量42.1%。在噬菌体基因组中共鉴定出121个编码蛋白（CDS），包括结构组成、DNA代谢与复制和包装以及细菌裂解相关的功能基因，发现一个tRNA基因，且未检测到如stx-1等致病性基因和mcr-1等耐药基因相关的基因。综上，噬菌体SDYTW1-F1-2-2裂解谱较宽，具有良好的酸碱性、热稳定性以及安全性。本研究为后续开展针对耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗研究提供依据。

为开发噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂,用于沙门菌的防控,采用生物信息学及异源表达蛋白的方法,获得鼠伤寒沙门菌噬菌体T139的裂解酶,并验证裂解酶对鼠伤寒沙门菌的裂解活性。通过对鼠伤寒沙门菌噬菌体T139基因组进行分析,发现该基因组全长38 854 bp,平均GC含量为49.10%,不包含tRNA基因。进化树分析表明噬菌体T139属于T7噬菌体属,共预测出43个ORFs,有23个被赋予已知功能。多序列比对及保守结构域分析表明,orf 40基因编码的蛋白(LysT40)包含126个氨基酸残基,具有内肽酶保守结构域,为可能的噬菌体裂解酶。LysT40二级结构中存在大量的螺旋结构(70.63%),使得该蛋白能够保持结构稳定。将orf 40进行异源表达、纯化,经过SDS-PAGE和Western blot分析,在10～15 ku处获得单一目标蛋白条带,纯化的蛋白质量浓度为280μg/mL。LysT40在30 min内对氯仿或EDTA预处理的鼠伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,吸光值OD_(600)相比于对照组分别下降0.18和0.31。

为探究单核细胞增生李斯特菌噬菌体裂解酶的特性及在食品基质中的初步应用，从NCBI获取李斯特菌噬菌体裂解酶lys039基因序列，分析其生物信息学，并在大肠杆菌中表达纯化，研究其裂解活性、对生物被膜的影响以及在牛奶基质中的应用。结果表明：1）裂解酶Lys039由341个氨基酸组成，分子质量为36.4 ku，等电点为9.81，其结构具有酰胺酶活性，对本实验室22株单核细胞增生李斯特菌、2株无害李斯特菌、1株伊氏李斯特菌以及1株威氏李斯特菌具有裂解活性，但是对葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及沙门菌没有显示出裂解活性。2）随着Lys039浓度的升高，裂解活性逐渐增强，最适温度为30℃，最适pH值为6.0。3)Lys039能显著清除单核细胞增生李斯特菌形成的生物被膜，并且可以降低牛奶中单核细胞增生李斯特菌的细菌数量。综上，Lys039温度耐受范围广、耐酸耐碱且裂解谱较宽，可显著清除生物被膜以及初步应用效果良好。本研究为进一步防治及快速检测单核细胞增生李斯特菌提供理论基础。

[目的]本文旨在分离一株针对耐多药肠炎沙门菌且宿主谱广泛的烈性噬菌体，并研究其生物学特性。[方法]从山东烟台某鸭场采集58份粪便样品，以鸭源肠炎沙门菌sdc-11为宿主分离噬菌体，并对噬菌体分离株进行形态学观察、温度和pH稳定性、最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线测定等生物学特性分析，测试其对73株不同血清型沙门菌的裂解谱，以及对sdc-11生物被膜形成的抑制和对成熟生物被膜的清除作用，最后进行基因组测序分析。[结果] 分离获得1株长尾噬菌体，命名为Salmonella phage YT 90。该噬菌体在30～60℃和pH 4～10的范围内，均表现出较好的增殖能力，最佳感染比是10~(-8)，潜伏期10 min，裂解期80 min，裂解量为278；可裂解76.7%（14/21）肠炎沙门菌、66.67%（28/42）鼠伤寒沙门菌和75%（3/4）鸡白痢沙门菌；在96孔细胞板上，YT90具有抑制sdc-11生物被膜形成的潜力，并能有效清除成熟生物被膜；全基因组测序发现，YT90的基因组全长121 240 bp，不含已知的毒力因子和耐药相关基因，不编码整合酶；基于末端酶大亚基构建的进化树表明，YT90与沙门菌噬菌体GRNsp50关系最近，属于根西病毒亚科（Guernseyvirinae）新泽西病毒属（Jerseyvirus）。[结论]从鸭场粪便样品中分离获得1株烈性噬菌体YT90，可裂解多种血清型沙门菌，耐受性强、潜伏期短、裂解量大，在防治沙门菌感染方面有较好的临床应用潜力。

从中华鳖(Trionyx sinensis)养殖池水中分离纯化到一株能裂解细菌的细菌AS212菌株,对其进行了形态观测和16S rRNA基因序列分析,构建了系统进化树,测定了其对不同来源菌株的裂解谱,分析了其对水体中细菌的裂解能力。结果表明,AS212菌株呈短杆状,端生单根鞭毛,直径0.6～0.7μm、长度1.0～1.2μm;该菌株不仅能裂解大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弧菌等革兰氏阴性菌,还能裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu...

【目的】研究克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的序列特征及其编码产物的理化性质、结构特征及同源性等。【方法】根据同源序列相似性设计引物,利用PCR、染色体步移等技术获得了基因序列,并对基因信号肽,疏水性和结构域等进行了分析。【结果】获得克雷伯氏菌2395 bp序列,其中K-PGL基因开放阅读框1710 bp,编码569个氨基酸,分子质量63.37 kDa,等电点7.17。编码蛋白具有信号肽酶切割位点,效率为0.864,序列中不含有半胱氨酸Cys,平均疏水指数为-0.449,为稳定存在的亲水蛋白。基因编码的蛋白具有内切聚半乳糖醛酸裂解酶基因家族特有的保守结构域,进化上与产酸克雷伯氏菌亲缘关系最近。【结论】获得了K-PGL基因序列及其特征,为进一步研究果胶酸裂解酶的生物学功能和应用提供依据。

【目的】筛选仔猪痢疾病原菌沙门氏菌特异性噬菌体,为噬菌体制剂的研制和仔猪痢疾的生物防治提供参考。【方法】从患痢疾仔猪粪便中分离致病菌沙门氏菌,鉴定后以其为宿主菌,从生活污水中筛选、纯化出特异性噬菌体,并以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为对照,检测该噬菌体的特异性。【结果】分离到了致病菌沙门氏菌,并得到了纯化的沙门氏菌噬菌体;经检测,该噬菌体只能裂解沙门氏菌,而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌没有作用。【结论】得到了纯化的可裂解沙门氏菌的特异性噬菌体。

为探究噬菌体作为新型生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎和乳制品及其加工过程污染，以及对生物被膜清除的能力，以ATCC 700603为宿主菌从某牛场水样中分离得到1株肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，并通过透射电镜观察噬菌体形态特征；通过双层平板法测定噬菌体宿主谱；通过最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性测定噬菌体生物学特性；通过全基因组测序分析基因组的结构特征、比较其进化关系；通过结晶紫染色法和平板计数法测定噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果；通过牛奶试验分析该噬菌体对牛奶中肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明：1）从牛场水样中分离获得肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，能形成清晰透亮噬菌斑，透射电镜观察vB＿KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构。2）测定噬菌体宿主谱，表明vB＿KpnM-YP11能够裂解18/34株牛源肺炎克雷伯菌。3）生物学特性结果表明vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1,vB＿KpnM-YP11感染宿主菌潜伏期为30 min，爆发期为50～90 min,110 min后进入平台期，平均裂解量为69PFU/cell，在pH(3～11)和温度（4～60℃）范围内活性稳定。4)vB＿KpnM-YP11基因组全长166 607 bp,GC含量为39.52%，注释结果显示共有276个ORF和15个tRNA，不含耐药基因及毒力基因。5)vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1时，具有显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成能力。vB＿KpnM-YP11效价为10～8 PFU/mL,10～9 PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。在室温条件下，12 h内vB＿KpnM-YP11使牛奶中细菌浓度下降98%。综上，本研究分离获得噬菌体vB＿KpnM-YP11潜伏期短、裂解效率高，不仅能抑制和清除生物被膜，同时对牛奶中肺炎克雷伯菌也有显著的抑菌效果，具有作为肺炎克雷伯菌生物抗菌剂的应用潜力。

以稀有放线菌小单孢菌40027菌株为指示菌,从土壤中分离得到1株新噬菌体,命名为ΦSCU20。在测试的9株放线菌菌株中,仅能感染小单孢菌40027菌株和A-M-01菌株。电镜观察显示噬菌体ΦSCU20由多面体的头部和尾部组成。噬菌体ΦSCU20生物学特性研究表明,噬菌体ΦSCU20形成噬菌斑时培养基中适宜的Ca2+和Mg2+浓度分别为8 mmol/L和20 mmol/L;噬菌体ΦSCU20在储存液中适宜的pH值为8;噬菌体ΦSCU20不耐高温,经40℃保温30 min后,其活力降低到48.65%,经60℃保温30 min后,则完全失活;噬菌体ΦSCU20基因组特性研究表明,该噬菌体的基因组为双...

分离鉴定裂解性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)K88噬菌体,并研究其生物学特性及裂菌效力。用双层平板法从猪场污水中分离噬菌体,通过透射电镜和酶切基因组对获得的噬菌体进行鉴定;同时测定了噬菌体最佳感染复数、一步生长曲线、酸碱稳定性、热稳定性等噬菌体的生物学特性及其体外裂菌效力。结果表明分离获得了一株产肠毒素性大肠杆菌K88强裂解性噬菌体,命名为PK88-4;其噬菌斑清晰透亮,周围无晕环;电镜显示:其头部呈正多面体对称,有可伸缩性尾部;核酸类型为双链DNA(基因组大小约60 kb);该噬菌体能耐受60℃左右高温、在pH值为5～10内效价稳定;最佳感染复数为0.01;潜伏期为10 min,暴发期为40...

本文综述了噬菌体展示技术的研究现状和发展趋势 ,着重描述了噬菌体展示技术的筛选方法及其在生命科学研究领域的广泛应用 ,结合目前我国天牛防治存在的问题 ,分析了噬菌体展示技术在天牛防治技术研究中的应用潜力

　对小麦条锈菌基因组DNA分离的氯化苄法和CTAB/SDS法进行了比较分析,认为后者无降解,质量高,可用于RAPD分析。试验对小麦条锈菌RAPD反应条件进行了优化,建立了标准化的小麦条锈菌RAPD反应体系,即10×ReactionBuffer2.5μL,MgCl22mmol/L,dNTPs0.15mmol/L,模板DNA40ng,引物10ng,Taq1U,ddH2O15.76μL。