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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨永超 王中元 杨小振 王永琦 张宇 张显
【目的】克隆西瓜自交系M08的ClP5CS基因(Cla006553和Cla017928)cDNA序列全长,探究其在抵御干旱和盐胁迫中的作用。【方法】利用西瓜基因组信息,以M80幼叶为材料,克隆Cla006553和Cla017928的编码序列,对其氨基酸序列进行生物信息学分析和同源分析;构建这2个基因的过表达载体转化农杆菌,采用浸花法浸染拟南芥,选取相应转基因T2拟南芥株系,检测其在脱落酸(ABA)、甘露醇、NaCl及干旱胁迫下的发芽率、根长、成活率及脯氨酸含量,研究Cla006553和Cla017928对拟南芥抗逆性的影响。【结果】Cla006553编码序列长2 166bp,编码721个氨基酸;Cla017928编码序列长2 145bp,编码714个氨基酸。Cla006553与Cla017928的核苷酸和氨基酸序列之间的相似性为分别为74.19%和77.12%,其氨基酸序列中含有ATP结合位点、脯氨酸反馈抑制位点、亮氨酸拉链、谷氨酰激酶结构域、NAD(P)H结合位点、亮氨酸结构域、谷氨酸半醛脱氢酶结构域。转Cla006553和Cla017928基因的拟南芥植株在ABA、甘露醇、NaCl和干旱胁迫下的发芽率、根长、脯氨酸含量、成活率等均高于对照,具有较好的耐旱和耐盐能力。【结论】克隆了西瓜P5CS的2个编码基因Cla006553和Cla017928,这2个基因均可增强转基因拟南芥植株的抗逆能力。
关键词：
西瓜 ClP5CS 拟南芥 渗透胁迫
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘春香 张卫华 曹齐卫 孙小镭
扩张蛋白是促进植物细胞壁伸展的一类蛋白质,黄瓜果实膨大过程中扩张蛋白具有重要作用。本研究以发育中的黄瓜果实RNA为试验材料,通过RACE方法克隆了黄瓜Cs-EXP10基因的5'端未知序列,进而获得了该基因的全长,序列分析显示该基因编码287个氨基酸,有扩张蛋白的特征序列。Southern杂交表明Cs-EXP10在基因组中是以单拷贝形式存在的。其表达具有组织特异性,在膨大过程中的果实中表达量高,显示其与果实的膨大有关。在叶和茎组织中也有少量表达,而在根和花中基本不表达。
关键词：
黄瓜 Cs-EXP10基因 克隆 表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
段雅如 高美玲 郭宇 梁晓雪 刘秀杰 徐洪国 刘继秀 高越 栾非时
【目的】基于GBS(Genotyping-by-sequencing)高密度遗传图谱初步定位结果，通过图位克隆方法对西瓜果形基因进行精细定位，并开发功能性分子标记，有助于全面研究果形基因的功能及分子标记辅助选择育种。【方法】利用114份纯合西瓜品系全基因组重测序数据及其果形指数表型进行GWAS(genome-wide association study)分析，结合GBS高密度遗传图谱初步定位结果确定果形基因候选区段，以商业小型西瓜品种纯化所得品系K2（椭圆形、FSI=1.54±0.13）和L1（圆形、FSI=1.11±0.07）为材料构建F2群体，通过开发分子标记对果形基因ClFSI进行精细定位，根据西瓜参考基因组‘97103’v1注释信息确定候选基因，并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行验证。【结果】利用1 152份F2群体，最终将ClFSI精细定位于3号染色体的FMFSI-1与FMFSI-2标记之间物理距离约63 kb区间内，共包含5个注释基因。其中Cla011257属于已报道与控制果实纵径和果形相关的SUN基因家族。经测序分析发现，西瓜椭圆形品系K2在该基因第3外显子上存在两个非同义突变位点Chr3:26846636 G-A和Chr3:26847041 G-A（‘97103’v1），分别导致天冬酰胺（Asn）替换为天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）替换为赖氨酸（Lys），并利用Chr3:26847041突变位点开发功能性分子标记FSICAPS-2。qRT-PCR分析表明，K2（椭圆形）与Charleston Gray（细长形）中候选基因表达量无显著性差异，但均显著高于L1（圆形）。【结论】本研究将控制西瓜果形的ClFSI精细定位于3号染色体63 kb区间内，推测Cla011257为最终目的基因，Chr3:26847041和Chr3:26846636突变位点是导致果形不同程度伸长的重要位点，并开发了可以同时鉴定Cla011257多种突变类型的功能标记FSICAPS-2。
关键词：
西瓜 果形基因 图位克隆 分子标记
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡宝刚 刘莉 焦定量
为了解ACC合成酶基因对西瓜花性型分化的作用机理,根据已报道的西瓜ACC合成酶(ACS)基因序列,设计特异性引物,以强雌性西瓜总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到4条特异性片段:Cit-ACS1为1 690 bp、Cit-ACS2为402 bp、Cit-ACS3为598 bp和Cit-ACS4为499 bp。序列同源性比对表明,该4个片段与已报道的西瓜ACC合成酶基因序列的同源性99.8%～100%。构建了西瓜ACC合成酶基因系统进化树,显示Cit-ACS1与甜瓜CMe-ACS2和黄瓜CS-ACS2亲缘关系最近;并对Cit-ACS1基因编码的蛋白进行了二级结构和三级结构分析。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
高威 戴琴 张攀 宋崇阳 朱杉杉 赖晓芳 高焕 阎斌伦
为了解泛素羧基端水解酶5基因(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5， UCHL5)在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育中的作用，本研究采用RACE技术克隆了脊尾白虾UCHL5全长cDNA，并对其在脊尾白虾不同组织和不同卵巢发育时期的表达情况进行了分析，在此基础上构建了pET32a-UCHL5原核表达载体，进行了诱导表达研究。结果显示，UCHL5 cDNA全长为1 440 bp，共编码329个氨基酸，预测其相对分子量为37.57 kDa，理论等电点为5.51。系统进化分析表明，脊尾白虾UCHL5氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性最高(83%)，与同为甲壳纲的凡纳滨对虾、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)聚为一支。荧光定量PCR分析结果显示，UCHL5在鳃中的表达量最高，其次是卵巢，且以上2种组织中的表达量均显著高于其他组织；在卵巢不同发育时期，UCHL5的表达呈先上升后下降的趋势，在Ⅴ期急剧下降到最低水平。构建的UCHL5原核表达载体，在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达UCHL5融合蛋白。本研究结果显示，UCHL5可能与脊尾白虾卵巢发育有密切的关系，为研究甲壳动物卵巢发育的分子调控机制提供了理论基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
徐博 任伟 徐安凯 王志锋 孙启忠
脯氨酸在提高植物抗逆性方面起着非常重要的作用。本研究以朝鲜碱茅茎叶组织提取的RNA为模板,根据已报道的P5CS基因同源序列设计引物,通过RT-PCR法扩增出1个P5CS的cDNA序列,全长2 158 bp,是一个完整开放阅读框,编码含716个氨基酸的蛋白,Genebank登陆号为:HQ637435。与其他植物P5CS基因进行同源性比对的结果显示,朝鲜碱茅P5CS基因的核苷酸和氨基酸序列与小麦的同源性最高。并对其信号肽、疏水性、跨膜结构、二级结构和主要功能域做了预测。半定量RT-PCR结果表明,PuP5CS基因在朝鲜碱茅的根部和叶片均有表达,但是根部的表达量较低,叶片中的表达量较高,在4种胁迫处...
[期刊] 华北农学报
[作者]
纪鸿飞 彭振英 马敬 毕玉平
Clp蛋白酶通过蛋白质水解作用来清除细胞内由逆境引起的异常和具有潜在毒性的蛋白或多肽,从而保证细胞正常的生理功能。从优质大花生鲁花14种子不同发育时期混合cDNA文库中发现一条序列,全长为1 212 bp,3′端含有polyA尾,通过blastx搜索得知其为Clp蛋白酶基因。该序列与GenBank中EZ736390.1的序列相似性达到99%。以该花生cDNA序列为模板设计引物,以花生幼嫩种子cDNA为模板克隆得到花生Clp蛋白酶基因。序列分析表明,AhClpP基因的开放阅读框长度为843 bp,编码280个氨基酸,预测其分子量为30.9 kDa,等电点为9.07,编码的蛋白包含S14-ClpP...
关键词：
花生 Clp蛋白酶 克隆 序列分析
[期刊] 华北农学报
[作者]
曹迪 许勇 郭绍贵 赵越 宫国义 张海英
乙烯受体基因ETR1是乙烯信号转导过程中的关键调控基因。研究根据ETR1基因的保守序列设计引物,以西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nadai var.lanatus)和黄瓜(Cucumis sativus L.)的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得序列长度分别为1 633 bp和1 491 bp的基因片段CLETR1和CSETR1。序列分析表明,CLETR1和CSETR1与Genebank中收录的多条ETR1基因的核苷酸序列同源性在80%~98%,氨基酸序列同源性在75%~98%。西瓜和黄瓜ETR1基因片段的编码序列存在明显的单核苷酸变异,共23个核苷...
关键词：
ETR1 基因克隆 西瓜 黄瓜
[期刊] 中国农业科学
[作者]
程立宝 秦智伟 李淑艳 丁国华 周秀艳
目的快速、准确划分出黄瓜雌性系是蔬菜育种工作者面临的重大任务,为了弥补目前物理方法鉴定的缺陷,本试验开展分子水平上鉴定的研究。方法从GenBank中查找到cs-acs1g基因序列,根据该序列设计两对引物,然后从黄瓜(C0208)雌性系材料中克隆2个基因片段,利用PCR扩增方法及田间调查手段相结合,验证cs-acs1g基因的2个片段和雌性系之间的相互关系。结果cs-acs1g基因的1013bp片段为黄瓜(CucumissativusL.)雌性系所特有,非雌性系没有此片段,而cs-acs1g基因的540bp片段无品种特异性。结论利用雌性系特异基因进行植株鉴定可以应用到实践中,是一种简便、快捷的可取...
[期刊] 华北农学报
[作者]
尹明达 罗蕊 任文静 王志妍 苏志敏 李茹鑫 陈圳 李玉玲 王艳 黄凤兰
在植物中，磷脂酰肌醇4,5-二磷PIP5K基因家族中的PIP5K2基因在调控植物生长中起到了关键作用，为探明PIP5K2基因在蓖麻中的作用，以蓖麻PIP5K2基因为研究对象，对该基因进行基因克隆、生物信息学及表达分析。结果表明，以蓖麻cDNA为模板，通过PCR获得了长度为2 136 bp的基因片段；通过对该基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析，确定该PIP5K2基因编码的蛋白氨基酸的个数为672,pI值为6.74,其分子质量为76.47 ku,平均亲水性系数为-0.636,是一种亲水蛋白质，其二级结构包括α螺旋、β转角、延伸链、无规卷曲；由预测结果可知，PIP5K2蛋白的三级结构与二级结构是一致的且与麻风树同源性很高。PIP5K2基因在单雌、标雌和两性系3种花序类型的五叶期时的相对表达量都普遍高，在主茎穗开花期相对表达量都普遍偏低；在标雌花序五叶期时有最高相对表达量，在两性花序的主茎穗开花期有最低相对表达量，最高相对表达量是最低相对表达量的80倍左右；在3种花序类型之间，PIP5K2基因在四叶期的相对表达量相似，但相较于单个花序类型植株的不同生长时期，PIP5K2基因在四叶期时的表达量要明显高于开花期。根据该结果推测，PIP5K2基因可能调控蓖麻植株中期的生长，与植株的矮化存在一定的相关性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
孙涌栋 张兴国 李新峥 李贞霞 陈碧华
以授粉后黄瓜幼果组织的总RNA为模板,利用简并引物,采用RT-PCR方法扩增出1条长度为480 bp的cD-NA片段。序列分析结果表明,该cDNA片段与来源于黄瓜根组织的CsEXP5片段序列(AF319471)同属一个基因,序列拼接后得到526 bp的cDNA序列。预测的CsEXP5蛋白具有一系列保守的Trp残基和HFD,KNFRV保守域。该蛋白属于α-扩张蛋白,与CsEXP10蛋白的同源性高达90%。该基因首次从黄瓜幼果中得以克隆,可能与黄瓜果实膨大生长有一定关系。
关键词：
黄瓜果实 CsEXP5基因 序列分析
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋维源 侯钰 赵剑宇 刘小凤 张小兰
【目的】AtRPL是拟南芥果实发育调控网络中的重要基因,参与胎座框的形成。同源克隆黄瓜的RPL,进行表达模式分析,在拟南芥中异源过表达CsRPL,探究CsRPL的生物学功能。【方法】根据拟南芥AtRPL信息在黄瓜基因组数据库中比对,克隆得到黄瓜CsRPL;利用MEGA5.2对CsRPL与其他物种同源蛋白进行氨基酸序列比对;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及原位杂交技术检测CsRPL在黄瓜中的表达模式;在拟南芥中异源表达CsRPL,并对转基因植株进行表达和表型分析。【结果】在黄瓜中存在两个RPL,分别命名为CsRPL1和CsRPL2,均含有BELL-Domain、Homeodomain保守域和两个EAR-Motif。CsRPL1在黄瓜各个部位均有表达,在开放的雄花中表达量最高,且在果实生长前期,其表达量随着果实的发育逐渐降低;CsRPL2在黄瓜各部位表达量均显著低于CsRPL1。原位杂交显示CsRPL1/2在黄瓜果实的胎座框中表达,且杂交信号在茎尖分生组织(SAM)的Central zone(CZ)区域富集。拟南芥异源过表达CsRPL1/2转基因植株的果荚变短,花粉育性降低,且种子发育受到抑制。【结论】CsRPL1/2参与生殖器官的发育,且可能存在功能冗余,在正常生长条件下,CsRPL1优先发挥功能。相比于AtRPL,CsRPL1/2的功能并不完全保守。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
张美玉 费诺亚 郭彦彤 田二渊 季苇芹 张晓晓 杨玉文 关巍 赵廷昌
瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)是西瓜、甜瓜等葫芦科植物上的重要病害,是一种世界范围内重要的检疫性、种传病害,病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)。Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)是西瓜噬酸菌致病过程中的关键毒力因子,参与调节细胞的多种生理生化反应。hpa(hrp-associated)基因是植物病原细菌Ⅲ型分泌系统hrp基因簇的重要组成部分,T3SS分泌蛋白在分泌过程中通常需要hpa基因编码的蛋白质介导,这些蛋白通常有利于植物病原细菌发挥其致病性。为了探究Ⅲ型分泌系统hpaB基因在西瓜噬酸菌致病过程中的功能,以西瓜噬酸菌Ⅱ型菌株Aac5为研究对象,构建hpaB基因缺失突变菌株及其互补菌株,并对致病力、致病相关表型以及相关基因表达量进行测定。结果表明:hpaB基因缺失后,对寄主植物西瓜和甜瓜的致病力显著减弱,并丧失了诱导非寄主烟草HR应答能力,运动能力减弱,生物膜形成能力增强。荧光定量结果表明:hpaB基因缺失后,影响T3SS相关基因及其他致病相关基因的表达。研究表明hpaB基因在西瓜噬酸菌致病过程中起到了重要的作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩金桓 王丽霞 高洪波 吕桂云
【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因ＣＩＭＹＢ转录因子，进行生物信息学及表达模式分析，为进一步解析ＣＩＭＹＢ在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和ＭＩＣｒｏａｒｒａＹ数据分析，获得与西瓜抗枯萎病相关的基因ＣＩＭＹＢ，采用ｒＴ－ＰＣｒ技术分离克隆ＣＩＭＹＢ Ｃ ＤＮａ全长序列；应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征；使用ＭＥＧａ５．０对ＣＩＭＹＢ蛋白序列及其同源序列进行多序列比对，并构建同源物种间系统进化树；采用ＧＦＰ标记的方法进行亚细胞定位，分析编码蛋白表达位置；将该基因片段通过ＮＤＥ Ｉ和ＸＢａ Ｉ双酶切连接至原核表达载体Ｐ Ｃｚ．．．
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
陈蒙 杨铭慧 刘月 LEE Sanghyeob 刘海峰
为明确药西瓜UDP-糖基转移酶催化葫芦素形成葫芦素配糖体的表达规律,以药西瓜品种"WM9"叶片为供试材料,采用RT-PCR技术克隆药西瓜UDP-糖基转移酶基因,并对编码蛋白进行分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR),以ACTIN为内参基因,分析获得的2个药西瓜UDP-糖基转移酶基因在不同组织器官中的表达规律。结果表明:克隆得到2个UDP-糖基转移酶基因,分别为1 546 bp和1 559 bp的cDNA全长序列,命名为UDP-E1和UDP-E2。对扩增获得的序列进行生物学信息分析,确定UDP-E1基因的完整开放阅读框(ORF)为1 314 bp,可编码氨基酸437个,理论分子量为49.02 ku,等电点为5.99,属稳定蛋白,Genbank登录号MK576125。UDP-E2基因的ORF为846 bp,可编码氨基酸281个,理论分子量为32.78 ku,等电点为5.23,属不稳定蛋白,Genbank登录号MK576126。这2个基因属于糖基转移酶超家族。UDP-E1和UDP-E2均与香瓜、黄瓜的UDP-糖基转移酶基因序列相似性最高。在各组织器官中,UDP-糖基转移酶均有表达,且在茎中表达水平最低,叶中表达水平最高。
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