【目的】昆虫胰岛素信号途径能够介导糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,简称GSK-3或GSK3)调控体内糖原及海藻糖等糖代谢过程,从而控制昆虫的各项生命活动。论文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飞虱(Nilaparvata lugens)体内对糖原与海藻糖代谢的调控作用。【方法】首先,基于GSK-3的cDNA编码序列,利用ExPASy工具翻译GSK-3氨基酸序列,预测蛋白分子量大小及等电点(pI);然后利用SignaIP4.1Server对其信号肽进行分析。其次,以笔者实验室饲养的褐飞虱为研究对象,从4龄开始,每12 h取材,取至成虫48 h。利用Trizol法提取褐飞虱总RNA,根据反转录试剂盒合成第一链DNA,以18S作为内参基因,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测褐飞虱GSK-3在不同龄期mRNA水平上的相对表达量。然后利用RNAi技术,向褐飞虱体内显微注射双链RNA(dsRNA)抑制GSK-3,以注射ds GFP的褐飞虱作为对照组。注射后48 h利用qRT-PCR技术检测GSK-3的表达情况,确定抑制效果。另外,取注射后48 h虫体,分别测定褐飞虱体内海藻糖、葡萄糖、糖原含量及海藻糖酶(trehalase,TRE)活性变化。最后采用qRT-PCR检测胰岛素信号通路胰岛素受体基因(insulin receptor,InR)、类胰岛素多肽基因(insulin-like peptides,Ilps)及海藻糖代谢途径TRE、海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phophate synthase,TPS)、糖原磷酸化酶基因(glycogen phosphorylase,GP)、糖原合成酶基因(glycogen synthase,GS)中相关基因的表达,分析GSK-3在胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径中的调控作用。【结果】褐飞虱GSK-3开放阅读框为1 914 bp,编码637个氨基酸;预测蛋白分子量为69.25 kD,等电点为9.15,为偏碱性蛋白,无信号肽结构,序列高度保守。发育表达模式结果显示GSK-3在不同发育阶段表达不一致,5龄若虫蜕皮前后低表达。GSK-3的dsRNA注射后48 h,与对照组ds GFP相比,GSK-3表达极显著下降,表明RNA干扰效果明显。糖原含量和两类海藻糖酶活性显著下降,而海藻糖含量显著上升,推测糖原和葡萄糖转化为海藻糖,作为其生理活动的能量来源。qRT-PCR检测发现,当GSK-3表达抑制后48 h,TRE1-2的表达量显著下降,而TRE1-1和TRE2的表达量极显著下降。另外,2个TPS基因、GS以及GP的表达量均极显著下降;胰岛素信号通路的2个InR基因和4个Ilps基因的表达同样被抑制,间接表明InR能够调控GSK-3的表达。【结论】褐飞虱GSK-3低表达后能够通过调控胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径相关基因表达来调控糖原及海藻糖代谢。相关研究结果有助于更加全面地探索褐飞虱等昆虫糖原合成酶激酶调控海藻糖及糖类物质平衡的潜在分子机理。

【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后,检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)和几丁质酶(chitinase,Cht)基因表达情况,探究不同的海藻糖酶(trehalase,TRE)在褐飞虱表皮中对几丁质代谢的调控作用。【方法】采用RNAi技术,以实验室饲养种群褐飞虱为材料,通过向其体内注射双链RNA(dsRNA)分别抑制单个海藻糖酶基因或同时抑制多个海藻糖酶基因,注射48 h

【背景】海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)在海藻糖合成中起着重要作用,其能够介导海藻糖代谢调控几丁质合成及昆虫发育。【目的】本研究通过抑制白背飞虱(Sogatella furcifera)TPS的表达,检测RNAi沉默SfTPS效果,观察白背飞虱蜕皮状况,测定几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)基因的定量表达,探究SfTPS在白背飞虱几丁质合成中的潜在调控作用。【方法】利用注射法RNAi技术,以实验室饲养多年的白背飞虱种群为试验材料,体外合成两个SfTPS(SfTPS1和SfTPS2)与GFP的双链RNA(dsRNA)后,分别注射到白背飞虱体内抑制TPS。首先,在dsRNA注射后48 h采用Trizol法提取白背飞虱的总RNA,反转录并合成第一链DNA后,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测TPS表达沉默情况,以确定RNAi的效果;其次,测定dsRNA注射后48 h和72 h白背飞虱整体几丁质含量并对翅发育畸形虫体进行拍照;最后,采用qRT-PCR技术检测白背飞虱SfCHS在mRNA水平上的相对表达量变化,分析SfTPS1和SfTPS2在几丁质合成调控中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,dsSfTPS1和dsSfTPS2的RNA注射后,能够促进SfCHS表达量上升,几丁质含量增加,白背飞虱成虫翅出现畸形。qRT-PCR结果显示,单个SfTPS dsRNA注射后本基因的表达能够被极显著抑制,与注射dsGFP相比,不足对照组表达量的30%,且单个SfTPS的dsRNA注射后,另外一个SfTPS表达同样显著下降;dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后,白背飞虱成虫翅均为长翅,出现一定比例的翅卷曲等畸形情况,其后48 h和72 h产生一定的死亡率;几丁质含量检测发现,SfTPS1和SfTPS2的dsRNA注射后72 h,几丁质含量显著上升。与注射dsGFP对照组相比较,SfCHS1与SfCHS1a表达量在dsSfTPS1注射后72 h极显著上升,在dsSfTPS2注射后48 h和72 h时极显著上升,且dsSfTPS1和dsSfTPS2注射后SfCHS1b的表达极显著增加。【结论】SfTPS能够通过调控白背飞虱几丁质合成酶基因的表达来控制几丁质的合成,研究结果有助于评价SfTPS在白背飞虱等昆虫中的调控作用并作为潜在控害靶标,为进一步开展和筛选有效的海藻糖合成酶抑制剂控制白背飞虱等害虫提供理论依据。

观测稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)糖原合成酶激酶基因Mo GSK3敲除突变体表型,明确Mo GSK3在稻瘟菌中的潜在生物学功能,为挖掘防治稻瘟菌新型药剂的潜在靶标提供参考。【方法】基于同源重组原理,用split-PCR方法获得稻瘟菌Mo GSK3敲除突变体菌株,将Mo GSK3基因克隆到p FL2载体上得到Mo GSK3-C融合载体,并将其通过PEG介导的原生质体转化法导入Mo GSK3突变体中得到回补菌株。培养观察野生型菌株Guy11、突变体菌株G3-9及回补菌株GC-1的菌落形态和生长状况,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测稻瘟菌产孢相关基因的表达量;观察稻瘟菌不同菌株的分生孢子形态,通过附着胞洋葱表皮穿透试验及接种水稻叶片,研究其致病力;通过KI-I2染色对野生型菌株Guy11及突变体菌株G3-9分生孢子和附着胞中的糖原运输能力进行观测。【结果】稻瘟菌Mo GSK3突变体存在多个表型缺陷,与野生型菌株Guy11相比,Mo GSK3突变体菌株G3-9菌落直径显著变小,生长缓慢,产孢相关基因表达量下降且分生孢子出现末端伸长畸形的状态。Mo GSK3基因缺失还会导致稻瘟菌菌丝末端无法形成正常的分生孢子梗,附着胞无法穿透洋葱表皮形成侵染菌丝,接种划伤水稻叶片也无法形成褐色病斑。对Mo GSK3突变体菌株G3-9分生孢子及附着胞进行糖原染色后发现,突变体菌株G3-9在糖原转运能力方面存在明显缺陷。【结论】Mo GSK3基因参与稻瘟菌的生长、分生孢子形成及形态建成、侵染、糖原转运等过程,是稻瘟菌重要的毒力因子。

【背景】昆虫海藻糖合成酶基因是昆虫海藻糖合成的主要基因,大多数昆虫中只拥有一个海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)基因,部分昆虫存在一个海藻糖-6-磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)基因。前期研究发现褐飞虱(Nilaparvata lugens)中拥有两个TPS,对其功能研究发现TPS不仅能够调控海藻糖代谢,还可介导海藻糖酶调控几丁质合成与降解途径,控制昆虫的蜕皮过程。【目的】通过对褐飞虱转录组测序分析获得了一个新的TPS,检测该基因在褐飞虱不同发育阶段的表达情况,探究该基因的功能与前期发现的两个TPS的区别。【方法】对获得的新TPS基因序列采用克隆技术获得全长c DNA序列,经验证正确后,对其蛋白的一级、二级、三级结构及与其他昆虫的TPS进行比对分析,最后采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术测定3个不同TPS在褐飞虱不同发育阶段的表达,并采用RNA干扰(RNAi)技术抑制TPS3的表达。【结果】在前期研究的基础上,克隆出一个新的TPS,并命名为TPS3。TPS3开放阅读框长度为2 352 bp,编码783个氨基酸,预测蛋白分子量为88.9 kD,等电点为5.47,具有亲水性结构。生物信息学分析表明,褐飞虱3个TPS蛋白具有较高的同源性,都具有TPS和TPP两个保守结构域及其他特征序列,并且α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占的比例较为接近。褐飞虱不同发育阶段3条TPS的相对表达量不同,TPS1的相对表达量从4龄0 h开始逐渐上升,至成虫阶段达到最高,TPS2的相对表达量从4龄末期开始明显上升且在整个5龄阶段都有较高的表达,TPS3的相对表达量在5龄末期和成虫初期较高。单独干扰褐飞虱TPS3 48 h后被干扰基因的相对表达量下降,ds TPS3能有效抑制TPS3的表达。【结论】在褐飞虱中发现一个新的TPS(TPS3),其与褐飞虱中已经报道的TPS1和TPS2具有较高的同源性。不同发育阶段表达结果表明,3个TPS在发育过程中行使的功能不同。RNAi能够有效抑制TPS3的表达并导致褐飞虱蜕皮障碍和翅发育畸形。

【目的】丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PYK)是一种调节性糖酵解酶,负责调节糖酵解和糖异生之间的平衡,具有重要的生理作用。本研究通过分析异色瓢虫(Harmonia axyridis)3条HaPYK的序列结构,并结合RNA干扰(RNAi)技术,探讨HaPYK在瓢虫体内的生物学功能。【方法】基于从异色瓢虫全基因组中获得的3条HaPYK序列(被分别命名为HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2),通过生物信息学方法分析其理化性质和序列结构,以及与其他昆虫之间的同源性。然后采用显微注射的方法将体外合成的dsRNA导入羽化第1天成虫体内,在注射后48和72 h分别收集试验材料,提取虫体总RNA后进行反转录,随后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定3个HaPYK的表达水平以评估RNAi效果,并检测与海藻糖代谢相关基因的表达水平,最后检测葡萄糖、糖原、海藻糖含量以及两种海藻糖酶的活性。【结果】HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2的开放阅读框分别为1 350、1 569、1 656 bp;蛋白大小分别为449、522、551 aa,理论等电点分别为5.04、5.02、5.01。保守结构域预测表明3条HaPYK均属于Pyruvate_kinase超家族。HaPYK二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲,另外也含有延伸链和β-转角。3条序列的寡聚物类型均为同源四聚体。系统进化树显示,HaPYK与同为鞘翅目的昆虫具有较近的亲缘关系,如马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。注射ds HaPYK1-1后,HaPYK1-2和HaTRE1-4的表达量显著下调,而HaPYK2、HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE2-like、HaTPS的表达量显著上调;注射ds HaPYK1-2后,HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE1-3、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTPS的表达量显著上调;注射ds HaPYK2后,仅HaTRE1-1表达量在48 h表现为显著上调,HaTRE1-3、HaTRE1-4、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTRE2-like的表达量均下调。与对照组相比,在ds HaPYK1-2组中48 h时可溶性海藻糖酶(TRE1)活性显著降低,海藻糖和糖原含量显著增加;在ds HaPYK1-1或ds HaPYK2组中48 h时葡萄糖含量减少,72 h时葡萄糖、海藻糖含量增加,膜结合型海藻糖酶(TRE2)活性显著提高;在ds HaPYK2组48 h时,海藻糖含量显著减少,而糖原含量显著增加。【结论】异色瓢虫体内存在3个HaPYK,通过导入外源ds HaPYK能成功干扰靶标基因的表达水平,且抑制表达后海藻糖代谢会受到影响,但3个HaPYK的调控机制不尽相同。

海藻糖为一种非还原性糖,广泛存在于细菌、藻类、真菌、植物和无脊椎动物中。海藻糖被称为昆虫"血糖",源于该糖为昆虫血淋巴中的主要糖类物质,在昆虫生长、发育、蜕皮等正常生理活动中有着重要的作用。昆虫的海藻糖先由海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)生成海藻糖-6-磷酸,然后通过海藻糖磷酸脂酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)最终合成海藻糖,在能量需求时通过海藻糖酶(trehalase,TRE)降解为葡萄糖,用于能量供给。

【目的】海藻糖酶（ｔｒｅｈａｌａｓｅ）可专一性地将一分子海藻糖水解成为两分子葡萄糖，在昆虫能量代谢和几丁质合成过程中发挥重要作用，因此，海藻糖酶已成为害虫控制的潜在靶标。本研究以重要农业害虫飞蝗（ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）为材料，探讨海藻糖酶基因的分子特性及生理功能，为飞蝗的有效治理提供理论依据。【方法】通过搜索飞蝗转录组和基因组数据库，获得４个海藻糖酶基因ｃＤＮａ全长序列，运用ｂｌａｓｔ、ｔｍｈｍｍ和ｓｉｇＮａｌＰ等相关软件分析其序列特征；利用ｃｌｕｓｔａｌＷ进行海藻糖酶全长氨基酸序列比对，ｍｅｇａ７构建海藻糖酶的系统进化树；运用ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａＮｓｃｒｉＰｔｉｏＮ－ｑｕａ．．．

在高糖基础日粮中分别添加10 mg/kg罗格列酮、10 mg/kg格列本脲、4 g/kg 1,6-二磷酸果糖,饲喂初始重量为(4.87±0.12)g的异育银鲫(Carassius auratus gibelio),对照组喂基础日粮,饲喂56 d后测定了这三种糖代谢调控剂对异育银鲫生长、血液生化指标和糖原代谢的影响。结果表明:与对照组相比,饲料中添加罗格列酮后饵料系数显著降低(P<0.05),添加罗格列酮和格列本脲后,肝体比显著增大(P<0.01);与对照组相比,罗格列酮能提高血清总蛋白含量(P<0.05)、球蛋白含量(P<0.01),降低血糖的浓度(P<0.01);1,6-二磷酸果糖能提高血清...

【目的】研究海藻糖及海藻糖酶在B型烟粉虱寄主谱扩张及与温室粉虱的竞争适应过程中的作用。【方法】以番茄饲养的B型烟粉虱与温室粉虱转移取食嗜好(棉花、甘蓝)或非嗜好(玉米)寄主植物后,其体内海藻糖含量及海藻糖酶活性的变化和响应。【结果】改变寄主会使B型烟粉虱和温室粉虱的海藻糖含量降低,其中棉花的作用最为明显,分别比对照减少了33%和25%;将植物种类转换为B型烟粉虱嗜好、温室粉虱亦可利用的寄主棉花或B型烟粉虱嗜好而温室粉虱非嗜好的寄主甘蓝,两种粉虱海藻糖含量的变化基本一致,而在两种粉虱非嗜好寄主玉米上B型烟粉虱(112.6%)较温室粉虱(60.8%)的恢复能力强、稳定性能好。尽管改变寄主对两种粉虱...

为了探究糖原含量差异显著的长牡蛎(Crassostrea gigas)自交家系和正反交家系在生理代谢水平上的差异,本研究开展了在一定温度(20℃)和盐度(32)下自交组和正反交组的滤水率、耗氧率和排氨率实验。结果显示,滤水率方面,自交组AA最大,BB最小,二者差异显著(P<0.05);正交组AB和反交组BA二者差异不显著且大小介于2个自交组之间,正反交组的杂种优势值为8.44%。耗氧率方面,自交组BB最大,正交组AB最小;自交组AA与BB差异显著(P<0.05),正反交组杂种优势值为-43.87%;耗氧率

分析–5℃处理松材线虫转录组数据,筛选出低温胁迫诱导差异表达基因胰岛素样生长因子受体基因Bx–daf–2。筛选低温胁迫和Bx–daf–2 RNA干扰松材线虫共表达基因,发现海藻糖酶基因Bx–tre–1受Bx–daf–2调控。进一步研究低温胁迫下松材线虫Bx–tre–1功能,结果表明,松材线虫Bx–tre–1表达量下调,参与低温胁迫响应,从而导致海藻糖酶活性降低,海藻糖含量升高。Bx–tre–1 RNA干扰处理组松材线虫低温胁迫下海藻糖酶活性下降,海藻糖含量升高,存活率升高,说明低温胁迫条件下,海藻糖含量升高有助于提高松材线虫存活率,Bx–daf–2与Bx–tre–1协同调控海藻糖含量升高,促进松材线虫低温抗逆。

用水稻敏感品种TN1和具有不同抗性基因的品种Mudgo ,ASD7和RathuHeenati饲养稻褐飞虱 (Nilaparvatalu gens) ,研究不同品种对褐飞虱体内酯酶、谷胱甘肽转移酶和多功能氧化酶氧脱甲基活性的影响。结果表明 ,褐飞虱在 3种抗性品种上饲养一代后 ,其酯酶活性与敏感品种上的试虫相比没有显著差异。然而 ,取食Mudgo和ASD7的雌成虫之间酯酶活性达到显著性差异 ;取食Mudgo和RuthuHeenati的雄成虫酯酶的Km 值分别为取食TN1的 2 78和 2 5 8倍。褐飞虱体内酯酶活性还因其生物型的不同而异。对褐飞虱生物型 1和生物型 2个体酯酶活力分布的测定...

前期研究证明糖原合成酶激酶(GSK3β)在花生黄曲霉敏感品种中上调表达。本研究对花生黄曲霉抗性品种和易感品种发育种子表达的GSK3进行了生物信息学和定量PCR的分析验证。结果表明,在抗性品系中,GSK3β基因在小果时期上调表达。由于GSK3β是油菜类甾醇信号传导的负调控因子,在细胞延长中起着抑制作用。因此推测GSK3β在花生果实发育中是种子和果实大小的抑制因子,与黄曲霉抗性有间接或直接的关系。

【目的】探索食用菌对高温胁迫后恢复响应差异的机制,为食用菌的高温育种研究提供理论基础。【方法】以肺形侧耳热敏感型菌株CCMSSC 00494和耐热型菌株CCMSSC 00499为材料,通过测定高温胁迫后恢复培养期间菌丝体内海藻糖代谢相关酶活性和基因相对表达量的变化,研究海藻糖代谢途径的应激响应。【结果】高温胁迫后恢复培养期间,两株肺形侧耳菌株海藻糖含量迅速降至对照水平,CCMSSC 00494中海藻糖含量降低速率高于CCMSSC 00499。CCMSSC 00494中海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)活性随着处理时间的延长增加,而CCMSSC 00499中的TPS活性缓慢下降。两菌株中合成海藻糖...