利用同源重组方法将来源于水稻细菌性条斑病菌的Harpin(HpaG Xooc)编码基因hpa1分别插入根围拮抗解淀粉芽孢杆菌FZB42的蛋白水解酶编码基因aprE和nprE位点,成功构建双拷贝Harpin表达工程菌株FZBHarpin。反转录PCR检测结果显示,hpa1能在RNA水平上正常转录表达。工程菌FZBHarpin发酵72 h后,其发酵液可引起烟草过敏性反应,这表明Harpin蛋白外泌胞外并保持生物活性。利用FZBHarpin浸种烟草后,烟草主根长达64.05 mm,比对照增加了30%,促生效果是FZB42的2倍。盆栽水稻白叶枯病防治试验结果显示,FZBHarpin防效为51.9%,比...

【目的】提高生防枯草芽孢杆菌ＪＮ２０９的稳定性及生防活性。【方法】利用基因工程技术，构建含ｈｒｐＺｐｓｇ１２基因的分泌表达载体，采用电转化方法将从大豆细菌性斑点病菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏＮａｓ ｓｙｒｉＮｇａｅ ｐｖ．ｇｌｙｃｉＮｅａ）中克隆到的ｈｒｐＺｐｓｇ１２基因转化至枯草芽孢杆菌ＪＮ２０９中，同时采用抑菌圈法测定宿主菌与基因工程菌抑菌活性的变化，评价其作为生物农药在田间对烟草病毒病的生防效果。【结果】成功构建了重组枯草芽孢杆菌基因工程菌ＪＮ２０９／ｐＷＢ９８０－ｈｒｐＺｐｓｇ１２。抑菌活性分析表明，基因工程菌株在保持原始宿主菌株抑菌活性的同时，对部分靶标菌的抑菌效果有明显提高。烟草病毒病田间．．．

【目的】提高生防枯草芽孢杆菌JN209的稳定性及生防活性。【方法】利用基因工程技术，构建含hrpZPsg12基因的分泌表达载体，采用电转化方法将从大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因转化至枯草芽孢杆菌JN209中，同时采用抑菌圈法测定宿主菌与基因工程菌抑菌活性的变化，评价其作为生物农药在田间对烟草病毒病的生防效果。【结果】成功构建了重组枯草芽孢杆菌基因工程菌JN209/pWB980hrpZPsg12。抑菌活性分析表明，基因工程菌株在保持原始宿主菌株抑菌活性的同时，对部分靶标菌的抑菌效果有明显提高。烟草病毒病田间小...

【目的】提高生防枯草芽孢杆菌JN209的稳定性及生防活性。【方法】利用基因工程技术,构建含hrpZPsg12基因的分泌表达载体,采用电转化方法将从大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)中克隆到的hrpZPsg12基因转化至枯草芽孢杆菌JN209中,同时采用抑菌圈法测定宿主菌与基因工程菌抑菌活性的变化,评价其作为生物农药在田间对烟草病毒病的生防效果。【结果】成功构建了重组枯草芽孢杆菌基因工程菌JN209/pWB980-hrpZPsg12。抑菌活性分析表明,基因工程菌株在保持原始宿主菌株抑菌活性的同时,对部分靶标菌的抑菌效果有明显提高。烟草病毒病田间...

扩增了炭疽芽孢杆菌PA基因,构建了原核表达质粒pET-28a-PA,并对其进行了诱导表达,对表达产物免疫原性和免疫保护效果进行了研究。结果表明,PA基因的长度约为2 205 bp,PA蛋白的相对分子质量为83 ku;rPA蛋白具有良好的免疫原性,初免后10 d即可检测到特异性抗体,第3次免疫后抗体水平明显升高,可达1∶12 800;rPA蛋白刺激小鼠产生的特异性抗体亚型以IgG 1为主;rPA蛋白在体外对小鼠脾脏细胞有促进生长和增殖作用。rPA免疫组小鼠脾脏中CD4+细胞显著增加,免疫应答趋向T h2型反应,说明rPA介导的免疫反应以体液免疫为主。rPA具有一定的免疫保护作用,保护率达到50%...

侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB600中,转化子pWT22-BLG4/WB600在IPTG(1.0 mmol.L-1)的诱导下,发酵液上清中的蛋白酶活可达到620 U.mL-1,高于出发菌株G4的BLG4酶活(240 U.mL-1).经SDS-PAGE分析,重组子pWT22-BLG4/WB600产生了一条分子质量约为30 ku...

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222...

【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基...

【目的】研究萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)XW2胞外蛋白的抑菌活性及其特性,探索植物病害生物防治的新途径。【方法】采用滤纸片法和叶盘法,检测XW2胞外蛋白对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度(MIC)和叶盘抑菌活性,以及对该病菌菌丝和孢子萌发的影响;研究其对另外5种植物病原真菌(尖孢镰刀菌、金黄壳囊孢、犁头霉、细极链格孢和黑腐皮壳菌)的抑菌活性,并分析其抑菌活性在不同的pH(2,3,4,5,6,7,8,9,10和11)、温度(30,40,50,60,70,80,90,100,110和121

利用MALDI TOF MS技术 ,鉴定了将lpaB3基因转入枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168菌株所构建的工程菌GEB3产生的脂肽类抗生素种类。结果表明 ,GEB3仅产生表面活性素 (surfactin) 1种脂肽类抗生素。经LC MS分析 ,GEB3产生由 13、14和 15个碳原子的脂肪酸链构成的标准表面活性素变异体 (standardsurfactinisoforms)。生物活性检测表明 ,该工程菌产生的脂肽类抗生素表面活性素具有抑制小麦纹枯病菌和稻瘟病菌菌丝生长的作用

以北京、大连和日本3个产地的纳豆产品为试验材料,从中筛选可用于畜禽生产的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)蛋白酶高产菌株。先通过酪蛋白平板初筛得到9株芽孢杆菌,再以N1型纳豆芽孢杆菌为模式菌株,对初筛得到的菌株进行菌落和菌体形态观察、生理生化鉴定,确定有5个菌株为纳豆芽孢杆菌。测定5个菌株48 h发酵液中蛋白酶活性,结果表明:菌株NB1为蛋白酶高产菌株,发酵液中蛋白酶活性为19.41 U.mL-1,产蛋白酶特性在6代内可保持稳定。

采用Folin -酚试剂法测定在不同pH值时三株芽孢杆菌Y2 - 2、F14、Y1- 13的酶活力 ,研究细菌生长与蛋白酶活力的关系。结果表明 ,在细菌生长初期 ,蛋白酶活力较小 ,随着细菌生长进入稳定期 ,蛋白酶活力逐渐增大。在同一生长阶段 ,芽孢杆菌发酵液的蛋白酶活力随pH值的增加而增大 ,在pH值为 9时达到最大值。证明该三株菌所产蛋白酶均为碱性蛋白酶 ,其中以Y2 - 2、F14的酶活力基本相当 ,且在整个实验中测得的酶活力均比Y1- 13的酶活力大。

【目的】利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因标记枯草芽孢杆菌生防菌株CQBS03,以研究其在柑橘叶片上的定殖规律。【方法】采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合,并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接构建重组质粒pHY43G,以重组质粒电脉冲转化生防菌株CQBS03,培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析工程菌株GFP的表达情况,然后进行工程菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用叶片喷雾方法接种,平皿稀释分离培养方法测定CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。【结果】重组菌C...

以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊蛋白基因下游序列的基因敲除载体pRN5101UKD,为后续外孢囊蛋白基因敲除工作做准备.

【目的】贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LJ02菌株能够诱导黄瓜等植物产生免疫抗病反应。本研究从生防菌LJ02中分离鉴定具有激发植物免疫活性的蛋白分子,通过验证其功能,进一步解析免疫蛋白的免疫信号通路。【方法】用硫酸铵沉淀法处理LJ02菌株发酵液,离心获得LJ02蛋白粗提物,将其经凝胶层析后再利用半制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分离,收集不同峰值处的蛋白组分。以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)为靶标进行活性组分的筛选,从而获得具有免疫活性的组分。液相质谱联用仪(LC-MS)检测分析活性组分后发现,在组分F-23中含鞭毛蛋白(flagellin,Flg~(LJ02))。将鞭毛蛋白Flg~(LJ02)进行原核表达并纯化,经过敏性坏死反应(hypersensitive reaction,HR)和抗病试验验证其免疫功能。为确定其主要免疫信号通路,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯(ethylene,ET)途径的相关合成酶基因ICS1、PAL、ACS1以及免疫相关抗性基因NPR1、PR-1、EIN2和EIN3,通过免疫相关抗性基因的相对表达量解析鞭毛蛋白Flg~(LJ02)免疫信号转导途径。【结果】HPLC层析分离出贝莱斯芽孢杆菌LJ02菌液产生的60个外泌蛋白组分(F-1—F-60),免疫烟草接种TMV后,观察分析发现组分F-20、F-23、F-41、F-44具有显著的免疫抗病效应,其中组分F-23抗TMV效果最为显著,其抑制率为81.7%。经过质谱数据分析发现该组分包含鞭毛蛋白Flg~(LJ02)等7种物质。选择鞭毛蛋白Flg~(LJ02)为研究对象构建表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导表达后破碎细胞,获得粗提蛋白。将粗提蛋白过柱、透析纯化后的Flg~(LJ02)渗入珊西烟(Nicotiana tabacum var. xanthi)叶片,24 h后能观察到过敏性坏死反应。将Flg~(LJ02)稀释为终浓度50、100、200μg·mL~(-1)的稀释液后预处理珊西烟叶片,24 h后接种TMV,其对TMV的枯斑抑制率分别为65.6%、76.1%、88.1%。用鞭毛蛋白Flg~(LJ02)处理珊西烟,其SA途径和ET信号途径的免疫抗病相关基因ICS1、PAL、NPR1、PR-1、ACS1、EIN2、EIN3的相对表达量在24—48 h均显著上调。【结论】贝莱斯芽孢杆菌LJ02外泌的鞭毛蛋白Flg~(LJ02)可以激发珊西烟植株的免疫防御反应,提高烟草植株对TMV的抗病性。