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[期刊] 华北农学报
[作者]
陈红英 黄青云 崔保安 李新生 管倩 刘金朋
为构建表达鸡IL-18的重组禽痘病毒,将含痘病毒启动子LP2EP2驱动的鸡IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681/ChIL-18。将pSY681/ChIL-18转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达鸡IL-18的重组禽痘病毒rFPV-ChIL-18。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组病毒rFPV-ChIL-18又进行了多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用鸡IL-18基因特异引物进行PCR,扩增出1条约0.6 kb的带。收集含鸡IL-18蛋白...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈吉刚 陈维虎 周继勇 王金勇 齐静 郑肖娟 俞照正 孙红霞
将去除信号肽的鸡IL-2基因编码框克隆到原核表达载体pBAD/HisB,实现了重组鸡IL-2(rchIL-2)蛋白在大肠杆菌中的高效表达。SDS-PAGE分析显示,表达蛋白的分子量约为18kD。用rchIL-2为抗原制备了单克隆抗体和多克隆抗体,建立了检测rchIL-2含量的抗原捕获ELISA,探讨了天然chIL-2蛋白的体外表达动力学。非变性条件下纯化的rchIL-2(0.4ng)对ConA活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性,而对鸭及鹅的T淋巴细胞无增殖活性。抗chIL-2多克隆抗体可完全中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白的生物学活性,而单克隆抗体无中和rchIL-2和天然chIL-...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王淑娟 陈红英 魏战勇 刘金朋 耿静微 崔保安
采用RT-PCR技术自豫南黑猪脾淋巴细胞中扩增猪IL-2基因(pIL-2),RT-PCR产物进行T-A克隆并测序,获得了猪IL-2基因序列。将BamHⅠ酶切的猪IL-2基因非定向克隆到BamHⅠ酶切并去磷酸化的pSY538载体上,通过PCR、酶切和测序鉴定,筛选正向插入的重组质粒pSY538/pIL-2。NotⅠ酶切pSY538/pIL-2后,得到含有双启动子LP2和EP2的猪IL-2基因片段,将其亚克隆到含有LacZ基因的pSY681载体上,筛选正向插入的重组禽痘病毒转移质粒pSY681/pIL-2。测序结果表明,克隆的豫南黑猪IL-2基因长482 bp,包含1个完整读码框(465 bp),...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王彦彬 卢中华 康相涛 宋素芳 孙桂荣 韩瑞丽 李国喜 李守义
参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PA...
关键词：
固始鸡 白细胞介素2 原核表达 生物活性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
闫若潜 谢彩华 吴志明 张志凌 刘光辉 刘梅芬
【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rCh...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘文强 赵宏坤
【目的】为了阐明重组蛋白的活性,置备具有生物学活性的重组白细胞介素18,应用于畜牧业生产。【方法】将含有山羊白细胞介素(gIL)-18基因的重组质粒pET-32a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中以1mmol·L-1IPTG诱导4h或者更长时间进行表达。【结果】经SDS-PAGE试验检测到了gIL-18与pET载体融合表达的重组蛋白。以该重组蛋白与佐剂混合后,免疫小鼠制备多克隆血清。经Western-blotting试验证实该重组蛋白具有免疫原性。经过包涵体变性、层析柱纯化和复性,证实该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性。这表明重组蛋白保留了天然蛋白大部分的...
关键词：
山羊 白细胞介素-18 表达 活性
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁巧玲 陈溥言
将马立克氏病病毒 (MDV)gB基因插入鸡痘病毒 (FPV)中 ,构建了含有MDVgB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV)。用rFPV、HVT冻干苗、rFPV +HVT疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,于 8日龄攻毒后观察疫苗免疫效果。实验结果表明 ,HVT、rFPV、HVT +rFPV疫苗免疫组比攻毒对照组病毒血症持续时间短 ;上述 3种疫苗免疫后用京 1株MDV(vMDV)攻毒 ,脾脏T淋巴细胞增殖反应处于较高水平 ,而攻毒对照组脾脏T淋巴细胞增殖反应减弱 ,两者差异显著(P
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王彦彬 崔保安 陈红英 王亚宾 张红英 魏战勇
【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽(honeybeemelittinsignalpeptide,HBM)取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨明凡 崔保安 陈红英 张素梅 魏战勇 李祥瑞
将鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)河南长葛株gD基因重组到鸡痘病毒基因组中,获得了能高效表达糖蛋白D的重组鸡痘病毒(rFPV-gD)。将rFPV-gD经皮下刺种途径接种30日龄的固始鸡,用ILTV商品弱毒疫苗经滴鼻、点眼途径免疫试验鸡,同时设非免疫对照鸡群。分别于免疫后7、14、21、28、35和42 d采血分离血清,用微量血清中和试验测定ILTV抗体效价,并于免疫后42 d用ILTV强毒攻击所有试验鸡只。血清中和抗体检测结果表明:疫苗对照组与重组病毒组差异不显著(P>0.05),而重组病毒组和疫苗对照组与空白对照组相比差异均显著(P
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王资生 齐志涛 黄贝 张启焕 仇明 邵荣
根据梭鱼IL-22cDNA序列设计特异性引物,从梭鱼脾脏中扩增IL-22用于表达片段,连接至载体pUC57。分别以BamHⅠ和KpnⅠ对含有目的基因的质粒和pQE-30进行酶切,连接并转化到大肠杆菌M15中,以IPTG进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。经SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE显示该IL-22表达质粒经IPTG诱导后,IL-22重组蛋白主要在菌体培养上清中表达。通过优化蛋白表达及纯化方法,成功获得了梭鱼IL-22活性蛋白。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘振兴 张殿昌 李建柱 江世贵
将扩增得到的黄鳍棘鲷Acanthopagrus latus白细胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)基因克隆到表达载体pQE30,并转化到大肠杆菌M15中进行表达。采用Ni2+-Chelating Sepharose FF层析对重组蛋白进行纯化,并用梯度透析对纯化蛋白进行复性。经SDS-PAGE和Western Blot分析,获得了分子量为21kD的重组白细胞介素1β(Recombinant Interleukin 1β,rIL-1β)。采用Percoll不连续密度梯度离心分离黄鳍棘鲷头肾白细胞,在分离液密度1.080g/ml的界面上可以有效富集白细胞。用不同终浓度的rIL-1...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
赵雅坤 史贤明 张忠明
人白细胞介素4(hIL4)是一种重要的免疫活性调节分子,与一些自身免疫性疾病有重要关系。将hIL4基因融合到衣藻叶绿体rbcL 5-’UTR和3’-UTR之间,组成5’UTR-hIL4-3’UTR片段,将其插入到来源于衣藻叶绿体基因组5.7 kb同源片段中,构建成pXhIL4同源重组质粒。利用电脉冲法将该质粒与含有aadA基因的壮观霉素抗性质粒p228共同转化衣藻叶绿体,从含100μg/mL的壮观霉素抗性平皿上筛选到阳性藻落,并通过PCR方法检测到hIL4基因,其共转化频率高达90%。经过western blotting印迹转移分析,证实了人白细胞介素4基因在衣藻叶绿体中获得成功表达,为进一步...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
邱丽华 冯娟 江世贵 张汉华 宋林生
采用同源克隆和锚定PCR技术,从军曹鱼(RachycentroncanadiumLinnaeus)中克隆到白细胞介素1β(interleukin 1β)基因cDNA的全序列。军曹鱼IL 1β的cDNA全长1104bp,3′非编码区域(UTR)为255bp,5′UTR为108bp,开放阅读框(ORF)为741bp,编码246个氨基酸,分子量大约为27 68kD,理论等电点为5 71。同源性分析表明,该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的IL 1β基因具有很高的相似性,并含有白细胞介素家族的签名序列(signature)。同时,利用RT PCR技术,对特异性病原刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行初步研究,...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈柳 余斌 倪征 华炯钢 叶伟成 云涛 张存
【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病，鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据２０１２年国际病毒分类委员会（ＩＣＴＶ）的报告，ＤＥＶ被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究，而近几年也有关于鸭瘟病毒（ＤＥＶ）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段，本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上，构建表达小鹅瘟病毒（ＧＰＶ）主要免疫原蛋白ＶＰ２的重组病毒ｒＤＥＶ－ＶＰ２，并研究其生物学特性，进而探讨重组病毒ｒＤＥＶ－ＶＰ２作为防治ＤＥＶ和ＧＰＶ的二联重组活载体疫苗的可能性。．．．
关键词：
鸭瘟病毒 鹅细小病毒 VP2 重组病毒
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈轶霞 王明明 龙玲 邵忠伟 刘俊林
通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头，串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE，将其克隆到原核表达载体pET-32中，采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒，构建pET32-mE质粒；用IPTG在不同条件下诱导表达，确定最佳表达条件，表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明，重组蛋白是分子质量为41 ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5 mmol/L，温度为37℃、诱导4 h时目的蛋白的表达量最...
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