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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
芮荣 邱妍 胡元亮 范必勤
以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的载体 ,对处于快速增殖期的 8株猪胚胎生殖 (EG)细胞 (4～ 9代 )进行转基因试验。用 1μgDNA和 2 μLLipofecTamine 2 0 0 0转染EG细胞后 ,共获得 4株转染EGFP基因的EG细胞系 (EG EGFP) ,可发出强绿色荧光 ;EG EGFP细胞连续培养 2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中 ,共注射 135枚胚胎 ,其中 112枚存活并发育至囊胚 (83 0 % ) ;86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞 ,其中 5 7枚囊胚在内细胞团 (ICM)上发现有E...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘洋 沙珍霞 陈松林 隋少飞 徐美瑜
通过显微注射的方法,将绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因注射入花鲈(Lateolabraxjaponicus)单细胞期受精卵动物极细胞质内。初步研究了显微注射后的花鲈胚胎的存活状况。在荧光显微镜下观察到了GFP的表达,多数胚胎表现为嵌合性表达。利用PCR技术,从花鲈尾芽期胚胎DNA中扩增出了特异片段,大小为750bp,表明显微注射胚胎中整合了外源GFP基因。
关键词：
GFP 花鲈 显微注射 转基因
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘丽华 沈卫德
将绿色荧光蛋白基因编码区克隆到转移载体pBacPAK8,与杆状病毒BacPAK6共转染昆虫细胞,通过同源重组和筛选,构建了整合有绿色荧光蛋白基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下呈现绿光。这样,就可在细胞内通过监测其表达情况,以了解病毒在不同细胞中的感染情况。
关键词：
绿色荧光蛋白 秋黏虫细胞 基因表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙莹 李俊平 黄小洁 李岭 曹明慧 李启红 李慧姣 杨承槐
【目的】鸭肠炎病毒（ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ｄｅｖ）不同毒株间存在明显差异，ｄｅｖ疫苗株的ｕＬ２基因在１９５ｂｐ后连续缺失５２８ｂｐ，导致第６５位氨基酸后连续缺失１７６ａａ～（［１］）。将绿色荧光蛋白（ＧＦｐ）基因插入ｄｅｖ ｕＬ２基因中，获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒，以研究ｕＬ２基因对ｄｅｖ生物特性的影响和探讨ｄｅｖ作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的ｄｅｖ细胞适应株ｄｎａ为模板，利用ｐｃｒ技术扩增出病毒ｕＬ２基因上下游序列并克隆入ｐＭｄ－１８ｔ载体；以ｕＬ２基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂，将ｃＭｖ启动子控制的含有ＧＦｐ－Ｇｐｔ基因表达盒克隆入ｄｅｖ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵轶君 董浩 潘红艳 徐芳 赵佳 步怀宇 李红民
为开发以绿色荧光蛋白(GFP)为基因的原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,通过PCR扩增获得GFP编码基因,经限制性核酸内切酶消化后将GFP定向克隆至原核表达载体pMAL-c2X中malE基因下游的EcoRⅠ与HindⅢ位点之间,与malE基因融合为一个表达框。重组产物转化E.coli TB1感受态细胞,在添加有50 mg/mLAMP、10μmol/L IPTG的LB平板上于37℃培养12～16 h后放置于25～30℃的培养箱中继续培养4～6 h,365 nmUV照射下挑取转化克隆,经扩大培养后用IPTG诱导GFP的表达并用SDS-PAGE检测表达效率。结果表明,融合在麦芽糖结合蛋白下...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丛义梅 马婧 孙瑞珍 王健宇 薛冰华 胡魁 尹智 刘忠华
【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞,通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】(1)与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比,性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长,二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响;(2)猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性,Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达,增殖能力呈现"S"型,即生长的潜伏期、对数期及平台期,猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体;(3)经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神...
关键词：
类胚胎生殖细胞 体外诱导 神经细胞 猪
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨继建 葛秀国 窦忠英
选择受精后30～50d的关中奶山羊胎儿为材料,参照小鼠原始生殖细胞(PGCs)分离得到了山羊的PGCs,将其分别培养在STO饲养层上,或与同源山羊成纤维细胞(GEF)及山羊睾丸支持细胞(GSCs)共培养。结果表明,3种方法均能获得类EG细胞。分离得到的类EG细胞在STO饲养层上仅传4代;培养在GEF上的效果最差,传至第3代时丢失;而在GSCs上培养的效果最好,可传6代。
关键词：
山羊 原生殖细胞 胚胎干细胞
[期刊] 林业科学
[作者]
李思蒙 王永林 黄冬辉 田呈明
以杨树炭疽病菌菌株C1-5-2作为受体,通过PEG介导的原生质体转化法,将含有潮霉素B(hph)和GFP表达基因的质粒gGFP转入杨树炭疽病菌菌丝的原生质体中。幼嫩菌丝在0.7mol·L-1NaCl溶解的1% Lysing enzyme酶解液的作用下酶解210min可以得到108·mL-1的原生质体;在PEG介导下,通过含有潮霉素浓度为300μg·mL-1的PDA选择培养基筛选转化子,每微克DNA获得41个转化子的平均转化效率。对转化子进行PCR鉴定表明:hph基因和GFP基因已经整合到杨树炭疽病菌转化子基因组中,通过荧光显微镜观察到转化子可以发出清晰的绿色荧光,且转化子的潮霉素抗性和GFP表...
[期刊] 水产学报
[作者]
苏建明 章怀云 肖调义 张学文 陈韬 苏建通 王跃智
通过体外重组,将绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到鲤鱼肌动蛋白基因启动子下游,构建成能在鱼体内表达绿色荧光蛋白的重组分子。用限制性内切酶PvuI酶切线性化后,通过显微注射法导入金鱼受精卵内,在转化后48h,可观察到绿色荧光,经PCR初步筛选后,对显阳性个体进行Southern杂交检测,结果表明,转化个体表现出较强的杂交信号。这说明绿色荧光蛋白基因能在金鱼体内整合、表达。
关键词：
绿色荧光蛋白 基因重组 金鱼 表达
[期刊] 水产学报
[作者]
夏立群 梁海鹰 张红莲 秦启伟
新加坡石斑鱼虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)是一种严重的能引起全身性疾病的病原体,对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV感染细胞多肽ICP46(infected cell polypeptides 46)基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞(fathead minnow cells,FHM)中进行融合表达,用荧光显微镜观察到ICP46-GFP融合蛋白主要分布于FHM细胞的细胞质中。根据SGIVICP46的序列,设计并体外化学合成了特异性干扰SGIVICP46的siRNA(siRNA-ICP46),与pEGFP-ICP4...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵彤 黄丛林 张秀海 于荣 王永勤 吴忠义
Tps1是生物保护物质海藻糖的关键合酶基因。构建含Tps1的玉米叶绿体表达载体,首先从玉米叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段;然后将编码酵母海藻糖合酶基因Tps1表达盒(Prrn-Tps1-TpsbA-ter)、草丁膦抗性基因Bar表达盒(RpsbApro-Bar-RpsbAter)、卡那霉素抗性基因Npt II和绿色荧光蛋白基因Gfp构建的融和基因表达盒(Prrn-Npt II/Gfp-RrbcLter)一起克隆到定点整合同源片段之间,构建了玉米叶绿体的稳定表达载体mTKGB。通过基因枪轰击法将mTKGB转化到玉米幼嫩叶片中,培养2 d后,在激光扫...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵彤 于荣 黄丛林 王永勤 张秀海 吴忠义
【目的】验证高羊茅叶绿体表达载体在高羊茅叶绿体中的瞬时表达情况,为今后在高羊茅叶绿体中稳定表达该载体,获得耐旱高羊茅的叶绿体转基因株系奠定基础。【方法】首先从高羊茅草叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段。然后将耐旱相关基因酵母海藻糖合酶基因tps1与水稻叶绿体16SrRNA基因的强启动子Prrn、烟草叶绿体基因psbA的终止子构建表达盒(Prrn-tps1-TpsbA-ter),连同草丁膦抗性基因bar表达盒、卡那霉素抗性基因nptII和绿色荧光蛋白基因gfp构建的融和基因表达盒一起克隆到定点整合同源片段之间,构建高羊茅叶绿体的稳定表达载体gTKGB。...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘胜 华进联 于海生 窦忠英
使用人类胚胎皮肤成纤维细胞(hESF)作饲养层,以血清替代物及一些细胞因子作无血清培养基,培养人类胚胎生殖(hEG)细胞。结果显示,在该培养体系下,人类胚胎生殖细胞能够存活、增殖,并表现出干细胞特有的形态学特征,具有很高的碱性磷酸酶(AP)活性,在体外能够保持未分化状态50 d左右。接种hEG细胞后,该体系能够比以前的人类胚胎生殖细胞培养体系形成更多的集落,并且这些集落AP活性维持更久。结果为人类胚胎生殖细胞的基础研究和临床应用提供了一种更为安全的培养方法。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘芳 梁运祥
以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因(gfp)序列,扩增产物连接到经酶切的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)整合载体pAXc,构建重组质粒pAXc-gfp.pAXc-gfp线性化后转入野生型枯草芽胞杆菌B411,gfp编码序列通过同源重组整合到B.subtilis B411染色体上,获得在无抗性选择压力下稳定表达绿色荧光蛋白的重组子B412.
关键词：
绿色荧光蛋白 枯草芽胞杆菌 基因标记
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
孙晓红 姚泉洪 陈明杰 潘迎捷
分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶Hind...
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