本试验首先用RT-PCR方法扩增出H9N2亚型禽流感病的HA基因,大小约1 700 bp,将其克隆到真核表达载体pcDNA中,并将该真核表达载体上的CMV启动子控制的含LacZ和HA基因表达盒克隆入马立克氏病病毒US2基因中,成功的构建了马立克氏病病毒的转移载体。然后,通过脂质体方法转染已感染马立克氏病病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过蓝斑筛选获得重组病毒。该重组病毒通过PCR方法鉴定证实其基因组中含有完整的HA基因。免疫酶反应和Western-blot证实重组病毒表达了禽流感HA蛋白,表达的HA蛋白具有血凝活性。

【背景】H9亚型禽流感病毒(AIV)存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒(DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量(10~3-10~6TCID_(50))rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制(HI)抗体,并在免疫后28 d,以10~8EID_(50)的剂量静脉注射H9N2AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-Δg E-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10~3TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价达到1:24,而10~4-10~6TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价在1:2~(2.4)-1:2~3。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10~3、10~4、10~6TCID_(50)免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10~5TCID_(50)免疫组保护率为80%(4/5),1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

将H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因构建到植物表达载体,经农杆菌法转入拟南芥基因组中,酶联免疫吸附(ELISA)测定分析T2代转基因株系,据OD值筛选获得HA基因高效表达株系;RT-PCR及Western blot分析进一步证实,这些转基因株系均可转录HA基因,翻译形成相应的蛋白质。拟南芥叶片中表达积累的HA蛋白经亲和层析纯化,Western blot分析检测到1条分子量为65 ku的蛋白质带,与预期的HA蛋白大小完全一致,没有发生蛋白质降解现象。表明禽流感病毒HA蛋白可在植物细胞中稳定表达,植物可用于生产禽流感疫苗。

以马立克氏病病毒超强毒(RB1B株)UL49为靶基因,利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA,再定向克隆至pSilencerTM2.1U6neovector载体中构建siRNA表达重组体,转化DH5α菌株,提取质粒酶切鉴定后,进行测序分析,证实为所需序列。以上结果表明,针对马立克氏病超强毒UL49基因的siRNA表达质粒已构建成功。

以鸡马立克氏病脾脏淋巴瘤继代细胞系MDCC MB1(MSB1)为研究对象 ,用southern和northern斑点分子杂交放射自显影等方法 ,证明了 5 氮胞苷可以阻断MSB1细胞DNA的甲基化 ,且去甲基化的DNA转录区和部分非转录区有特异增幅的转录产物mRNA ,说明这些区基因转录活性上升。用 5 氮胞苷处理MSB1细胞使其去甲基化后 ,该细胞DNA的内切酶BamHⅠ区域对DNaseI敏感性增高 ,该片段区的基因表达活性也增高。以上结果提示 ,DNA的去甲基化可以提高MDV的基因表达 ,进一步说明MDVDNA的甲基化在抑制MDV基因表达 ,维持MDV在淋巴瘤细胞株中潜伏感染状态可能起...

根据已发表的马立克氏病病毒(MDV)血清I型与鸡白介素2(IL2)DNA序列,设计两对引物,用PCR扩增出MDVgB基因和IL2基因,并克隆入pEGFPC1载体,构建了载体pC1gBIL。通过酶切分离外源基因表达盒,并将外源基因表达盒插入pTK2B质粒,成功构建了转移载体pTCgBIL。将转移载体pTCgBIL转染CEF细胞,培养36～48h后,经荧光显微镜观察,有荧光出现,证明该载体得到表达,并通过Westernblotting鉴定证明MDVgB和IL2的融合基因得到了有效的表达。

为了建立利用小麦生产禽流感口服疫苗的方法,选择禽流感病毒H5N1亚型表面抗原HA基因,与谷类作物启动子构建小麦表达载体,经基因枪法转入我国小麦栽培品种郑9023幼胚,在含5 mg/L草铵膦愈伤诱导培养基和分化培养基及含4 mg/L草铵膦生根培养基上筛选后,PCR鉴定获得转HA基因植株,Southern杂交分析转基因T1代植株证实,外源HA基因确已整合到小麦基因组中。

将马立克氏病病毒(MDV)GA 株基因文库中 BamH I I_3和 K_3克隆片段分别用 BamH I 加 Sal I 和 BamH I加 EcoR I 双酶切消化。含有编码 MDV 糖蛋白 B(gB)部分 DNA 的2.B kb、BamH I-Sal I 片段和1.1kb、BamH I-EcoR I 片段与 Sal I-EcoR I 消化的载体 pUR 222通过三聚体连接方式相连接。限制性核酸内切酶分析表明,重组质粒含有 MDV gB 基因,并且 MDV GA 株 gB 基因克隆在 EcoR I,Hind,Ⅲ,Xba I 和 Sal I 切点与 MDVRBIB 株相同。

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。

将马立克氏病病毒(MDV)超强毒株VP22基因插入真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的下游,构建EGFP-VP22融合基因真核表达载体pEGFP-VP22。将其转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-k1)中,通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况,并用RT-PCR检测VP22基因的表达。检测证实EGFP和VP22在CHO细胞中均得到了有效表达。

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成...

含有马立克氏病病毒糖蛋白Ｂ基因重组质粒的改造及其鉴定罗满林，陈溥言，张林元，蔡宝祥，邓小昭（南京农业大学动物医学院，２１００９５；南京军区军事医学研究所）ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＡＮＤＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＰＬＡＳＭＩ...

参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。

将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增。用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体。通过内切酶分析、地高辛（ＤＩＧ）—探针原位杂交、ＤＮＡ序列测定，确认克隆的Ｂ抗原基因正确。

目的以伪狂犬病病毒为载体,构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒,并研究其生物学特性。方法将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中,构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒,然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。结果利用检测PCV2ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+,同时用Southernblotting证实外源基因PCV2ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验(...