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[期刊] 中国农业科学
[作者]
琚春梅 陈焕春 郗鑫 刘正飞 曹胜波
目的以伪狂犬病病毒为载体,构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒,并研究其生物学特性。方法将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中,构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒,然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。结果利用检测PCV2ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+,同时用Southernblotting证实外源基因PCV2ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验(...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张秀珊 曹洪战 张丽青 刘涛 陈赛娟 孙继国
以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV2ORF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western-Blotting分析。结果表明,重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40 kDa,Western-blotting分析表明该蛋白具有PCV2抗原性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
潘群兴 何孔旺 温立斌 郭容利 黄克和
应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基因的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
谢燕婷 郑敏 石磊 王隆柏 张志刚
利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对猪伪狂犬病毒gB基因、猪圆环病毒2型ORF2基因和猪细小病毒VP2基因的保守区进行引物设计,选出扩增序列为猪伪狂犬病毒(373 bp)、猪圆环病毒2型(430 bp)和猪细小病毒(495 bp)的3对引物.敏感性和特异性试验结果表明,mPCR对3种病毒的核酸检测限量从猪伪狂犬病毒至猪细小病毒分别为1.62×10-6、1.47×10-6和1.28×10-4ng,对灭菌双蒸水、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒cDNA和猪瘟病毒cDNA的mPCR扩增结果均为阴性.mPCR可作为临床上猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型感染和猪细小病毒病的病原学快速诊断方...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈美玲 陈焕春 宋云峰 黄红亮
参照Genbank上公开发表的PCV1 全基因序列设计引物,以质粒pSK PCV为模板扩增出PCV1 ORF2基因,插入pMD18 T载体,对筛选出的阳性质粒进行测序,将测序结果同Genbank上发表的PCV1 基因序列相比较,同源性达97%,再与Genbank 上发表的PCV2 的ORF2 基因序列相比较发现PCV1 ORF2 和PCV2 ORF2的差异表现在两者在核苷酸序列的2个部位互相存在基因缺失现象。将推导出的PCV1 ORF2 的氨基酸序列同PCV2 ORF2进行比较,发现二者在几个功能区相当保守,尤其是N 末端的核定位序列、N 糖基化位点以及酪氨酸磷酸化位点。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王凤芝 温立斌 姚火春 何孔旺
【目的】确定类猪圆环病毒P1存在开放阅读框ORF2和ORF3;【方法】采用Trizol法,提取类猪圆环病毒P1分子克隆转染PK-15细胞的总RNA,纯化之后,分别用P1 ORF2和ORF3特异性引物进行RT-PCR,应用AxyPrepTM DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物,转化Trans5α感受态细胞,挑取单菌落,经PCR检测为阳性后测序。同时,利用rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技术分别扩增P1病毒ORF2和ORF3的5′-与3′-末端。另外,根据P1 ORF2和ORF3的序列预测其B细胞抗原表位,采用标准的逐步固相合成法合成表位肽,与载体蛋白K...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
冉智光 童光志 张绍杰 王玉春 黄勇富
根据已发表的伪狂犬病毒（ＰｒＶ）的基因序列，在ＰｒＶｇＥ基因起始密码子和终止密码子的上、下游分别设计一对引物ＰＣＬ１和ＰＣＬ２，在ＰＣＬ１和ＰＣＬ２的５端分别加上ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点，以ＰｒＶＭｉｎ－Ａ株ＤＮＡ为模板成功地扩增到约１．８ｋｂ的片段，经酶切鉴定为ＰｒＶｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物以ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ消化，回收后与经ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ酶解的ｐＵＣ１１９连接、转化，获得了明显大于载体的重组质粒，经限制性酶切和序列部分测定鉴定了阳性重组质粒ｐＲＺＥ。将ｐＲＺＥ分别经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ酶切，回收ｇＥ基因，分别克隆到真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ和杆状病毒载体...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
曾显成 吴异健 陈家祥 姚金水 吴宝成
采集福州郊区病仔猪的鼻腔黏液、脑、脾脏、肾脏、淋巴结等组织病料,研磨上清接种到非洲绿猴肾(Vero)细胞和狗肾(MDCK)细胞进行病毒分离,通过对分离病毒株进行形态学、血清学、荧光抗体试验、动物接种试验、PCR试验等鉴定,确定所分离的病毒为猪伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-FZ株.根据GenBank收录的PRV gD基因的序列设计一对引物,通过PCR方法扩增出约1579 bp的目的片段,并将其克隆到PCAGGS载体进行酶切鉴定、核苷酸序列测定和分析.结果表明,目的片段包含一个1203 bp的开放阅读框,编码400个氨基酸组成的多肽,与GenBank中有代表性的5株参考毒株相应基因序列比较...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏鑫铭 徐亚林 于春梅 曹瑞兵 周斌 陈溥言
根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400μg.mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre。利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达。结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419。将S0419感染已...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 王丽 杨继飞 郅玉宝 滕蔓 邓瑞广 肖治军 张改平
利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。
关键词：
狂犬病病毒 糖蛋白 胞外区 纯化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨增岐 田小艳 张涌 祝卫国 王旭荣 谢俊良 杨永宁 张锦俊
根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的序列,设计2对PCR引物,对疑似PCV2感染猪的血液、肺脏和淋巴结等病料进行套式PCR扩增检测,并对PCR检测为PCV2阳性的病料进行PCV2分离与鉴定。结果显示,PCV2在PK-15细胞上生长良好,但增殖较慢且不产生细胞病变;在第12代细胞培养物中用间接免疫荧光试验(IFA)和PCR扩增反应均能检测到PCV2,且特异性很强。表明试验分离的病毒为PCV2。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
汤智慧 郭抗抗 张彦明 王津津 李宇立 向华
【目的】分离得到猪圆环病毒2型(PCV-2)陕西杨凌株,测定病毒滴度(TCID50),并进行全基因组序列比对,为研制针对性更强的PCV-2疫苗提供理论依据。【方法】从经PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料中,分离病毒并接种PK-15细胞,通过PCR检测、间接免疫荧光试验及电镜观察,对分离病毒进行鉴定;用免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA),测定分离毒株的TCID50,并对其全基因组序列进行测定与分析。【结果】分离得到1株猪圆环病毒2型毒株,分离株在PK-15细胞上的TCID50为10-4.75。全基因组序列同源性比对发现,分离株与一加拿大分离株(DQ200735)同源性最高(99.4%)。【...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵丽 崔保安 文英会 陈红英
根据Genbank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因和猪细小病毒(PPV)的VP2基因的保守序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了PRV和PPV的单项PCR诊断方法,通过优化PCR条件最终成功地建立了PRV和PPV的复合PCR诊断方法。敏感性检测结果表明,对PRV的检测可以达到10-10.5/100μL TCID50、对PPV的检测可以达到10-9.5/100μL TCID50。对20头份病、死猪的血清、淋巴结、肺、肝等组织进行检测,结果5头份PRV阳性,3头份PPV阳性,其中3头份PRV和PPV同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。结果表明,PRV和PPV复合PCR诊断...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
温立斌 张丹 何孔旺 解建平 董美响
利用无缝克隆方法构建ＺＪ－Ｒ全长基因组的单拷贝分子克隆以及双拷贝串联分子克隆；通过生物信息学技术预测ＺＪ－Ｒ病毒结构蛋白的Ｂ细胞抗原表位，人工合成选定的表位肽，然后偶联ＫＬＨ免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体；免疫组化试验证实该多抗与转染ＰＫ１５细胞的ＺＪ－Ｒ双拷贝串联分子克隆具有反应性。结果表明构建的ＺＪ－Ｒ双拷贝串联分子克隆具有感染性。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
颜其贵 郭万柱 余光开 王琴 娄高明
用限制性核酸内切酶NcoI消化含有伪狂犬病病毒(PRV) Fa株Bam HI-7片段的质粒PBB7,以低融点琼脂糖回收目的片段, 经连接并转化E.coliDH5a, 获得缺失了gI和部分gp63基因的重组质粒PPB7-1。将PRVFa与PPB7-1DNA共同转染PK15单层细胞,待出现50% 以上细胞病变时收获病毒, 并以蚀斑法得到纯化重组病毒株, 命名为PFDI/D63。小鼠试验证实, 缺失株对小鼠具有一定的免疫原性。
关键词：
伪狂犬病病毒 基因缺失 重组
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