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[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐义刚 崔丽春 葛俊伟 唐丽杰 赵丽丽 李一经
【目的】研究以干酪乳杆菌作为传递抗原活载体表达猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白的免疫特性。【方法】将构建的重组猪细小病毒(PPV)VP2基因的细胞表面表达型载体pPG-VP2电转化干酪乳杆菌L.casei393,获得阳性重组菌pPG-VP2/L.casei393。重组菌以2%乳糖为诱导物,在MRS培养基中进行诱导,经SDS-PAGE、Westernblot及间接免疫荧光分析,目的蛋白获得表达。将重组菌及空质粒菌株分别口服接种Balb/c小鼠,收集粪便及肠黏液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性sIgA,采集血液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性IgG,并对获得的抗体进行PPV中和活性的测定。【...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
廖健淇 谢芝勋 张民秀 张艳芳 罗思思 李孟 谢志勤 谢丽基 邓显文 范晴 曾婷婷 黄娇玲 王盛
【目的】原核表达鸡细小病毒（ChPV）的NS1和VP2蛋白，制备其多克隆抗体，为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列，构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2，将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达，优化表达条件，以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和免疫印迹（Western-blotting）方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体（SPF）鸡获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价，以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析结果显示，NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104.0和87.0 kD，与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选，结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）终浓度1.0 mmol/mL，16 ℃诱导表达过夜；VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL，20 ℃诱导表达过夜。可溶性分析结果显示，NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在；间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1︰10240000；Western-blotting鉴定结果表明，His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合；IFA分析结果显示，VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体，可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘敏 赵丽丽 葛俊伟 欧笛 王相清 刘弈 张伟 李一经
根据传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3蛋白的全基因序列,设计并合成引物,以IPNV(ATCC VR-1318)细胞培养毒提取的核酸为模板,对传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统进行了构建研究。结果显示:进行RT-PCR扩增得到截短的VP3基因约615 bp目的片段,将其克隆到pMD18-T Simple载体,经酶切、PCR扩增和序列测定后显示目的片段正确;将目的片段分别亚克隆到乳酸菌细胞表面表达型载体和分泌表达型载体,电转化于干酪乳杆菌,获得了阳性重组菌株。结果表明,通过本实验方法可构建表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的干酪乳杆菌表达系统,为实现IPNV VP3蛋白在乳酸菌中的表...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
麻丽霞 张婷婷 张优优 周罡 张智英
【目的】开发一种针对低密度脂蛋白成分ApoB100的新型重组酵母疫苗,为动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的防治提供一种思路。【方法】利用PCR得到包含编码ApoB100的3 136-3 155位氨基酸残基的目的片段,将其克隆到酵母表达载体JMB88-HA-OVA-MCS上,构建JMB88-HA-OVA-hApoB载体,用硫酸铜诱导表达后获得HA-OVA-hApoB融合蛋白。采用口服的方法对昆明小白鼠免疫成功表达HA-OVA-hApoB蛋白的酵母细胞12周,每周1次,每次1×108个酵母细胞,免疫结束后4周采血,用Western blot检测小鼠是否产生特异性抗体。【结果】P...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
张正坤 吴祖建 沈建国 谢联辉 林奇英
从烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)感染的发病烟草叶片中提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到其运动蛋白基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上.DNA序列分析表明,所得运动蛋白基因全长为807 bp,与已报道的TMV-U1株系核苷酸和氨基酸同源性均为100%.将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-29a上,并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导4 h后蛋白表达量达到最大,超声波显示所得融合蛋白以不可溶形式存在.SDS-PAGA检测蛋白表达情况,表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体,ELISA测定效价为25600,Western-blot...
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭建军 袁林 曾静 邱小忠 付锦楠
以干酪乳杆菌为传递载体，以开发食品级安全的减蛋综合征病毒疫苗为目标，构建了一个温度敏感型自杀型质粒系统ｐ ＯＲＺｐ－ＵＫＤ。将该质粒电转化到干酪乳杆菌Ｌ．ｃａｓｅｉ中，经过２次升温处理和５－氟尿嘧啶抗性筛选，挑选阳性克隆，采用ｐｃＲ和ｓＤｓ－ｐａＧｅ方法进行鉴定。ＫｎＯｂｓ基因整合到干酪乳酸杆菌基因组内，并实现融合蛋白ＫｎＯｂｓ的分泌表达。表明得到了一株具有无任何选择性标记、携带有ＫｎＯｂｓ表达盒元件的基因组整合的重组干酪乳酸杆菌ＫｎＯｂｓΔＵｐｐ Ｌ．ｃａｓｅｉ，且整合的外源基因能够随着细菌的复制而进行表达，为减蛋综合征病毒免疫保护性抗原ＫｎＯｂｓ疫苗的进一步研制提供了试验数据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
于天飞 谢鹏宇 孙婉姝 李静 尹海畅 黎明 于志丹
为了在大肠杆菌中表达抗鹅细小病毒(GPV) NS1蛋白单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,并测定其与NS1蛋白结合活性。对抗GPV NS1蛋白单克隆抗体VL、VH基因核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工合成获得了含有可变区基因的重组质粒pUC57-VL和pUC57-VH。然后用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pUC57-VL、pUC57-VH,回收340 bp的VL基因和370 bp的VH基因。目的基因通过Bam HⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a,获得重组质粒pET-VL和pET-VH。重组质粒经Bam HⅠ单酶切和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-VL和TRX-VH的表达,分子量分别为30.3,31.4 ku。纯化后的重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性结合,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。间接ELISA分析表明,0.4μg的TRX-VH可与25 ng的GST-NS1蛋白特异性结合而0.4μg的TRX-VL不能与各包被量的GST-NS1蛋白特异性结合,TRX-VH与GST-NS1蛋白的特异性结合可被1∶200稀释的GPV感染鹅血清完全阻断。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李斌 苏乾莲 赵武 梁家幸 梁保忠 何颖 秦毅斌 何苹萍
为了进一步研究猪细小病毒自然弱毒株(PPV-N株)的自然弱毒分子生物学机理,对PPV-N株VP2基因进行克隆、测序和原核表达研究。结果表明,成功构建PPV-N株VP2基因的克隆重组质粒pMD18-T-VP2及表达重组质粒pET32a-VP2,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,PPV-N株VP2基因在BL21(DE3)plysS菌中成功进行融合表达,表达出约85.4 KDa的VP2融合蛋白,且表达的VP2融合蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应。PPV-N株VP2基因的成功克隆及原核表达为今后研究PPV-N株的自然弱毒的分子生物学机理和研制PPV诊断抗原奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈柳 余斌 倪征 华炯钢 叶伟成 云涛 张存
【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病，鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据２０１２年国际病毒分类委员会（ＩＣＴＶ）的报告，ＤＥＶ被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究，而近几年也有关于鸭瘟病毒（ＤＥＶ）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段，本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上，构建表达小鹅瘟病毒（ＧＰＶ）主要免疫原蛋白ＶＰ２的重组病毒ｒＤＥＶ－ＶＰ２，并研究其生物学特性，进而探讨重组病毒ｒＤＥＶ－ＶＰ２作为防治ＤＥＶ和ＧＰＶ的二联重组活载体疫苗的可能性。．．．
关键词：
鸭瘟病毒 鹅细小病毒 VP2 重组病毒
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
汪舒庆 葛向阳 陈正军
以干酪乳杆菌作为传递载体,构建表达人表皮生长因子的重组干酪乳杆菌,探讨原位表达特定蛋白的可行性。采用SOE PCR合成人表皮生长因子序列,克隆到干酪乳杆菌表达载体pELWH,构建pELWHhEGF重组质粒,将该质粒电转化干酪乳杆菌宿主,采用Western blot及间接免疫荧光检测目的蛋白的表达,并通过细胞增殖实验验证目的蛋白的生物学活性。结果表明:在重组菌的细胞表面及培养液上清中均检测到SlpA-hEGF融合蛋白,分子质量约55ku;细胞增殖实验显示SlpA-hEGF融合蛋白及干酪乳杆菌上清均能显著促进NIH/3T3细胞的增殖。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王秋珍 邓自腾 兰静 刘雪连 范祥伟 薛毅 马云飞
为研究干酪乳杆菌对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎小鼠焦虑样行为的影响及对结肠的保护作用，本研究分为对照组、DSS组、干酪乳杆菌组和干酪乳杆菌预防组，通过旷场试验比较各组小鼠行为学差异；统计并比较不同组小鼠体重、结肠长度、肠道上皮、炎性浸润、粪便潜血等的变化；HE染色法检测各组小鼠肠道结构的变化。结果显示：1)干酪乳杆菌预防组小鼠在旷场箱中活动的距离及在中央区域停留的时间显著增加(P<0.05);2)与DSS组相比，干酪乳杆菌预防组结肠长度、小鼠体重显著增加，组织学评分和疾病活跃指数显著降低(P<0.05),结肠肠道结构更加完整。综上，干酪乳杆菌可减轻小鼠焦虑样行为，缓解DSS对小鼠结肠的损伤，发挥对急性肠炎的保护作用。
关键词：
干酪乳杆菌 结肠炎 小鼠 行为学
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘建奎 魏春华 侯喜林 余丽芸 王桂华
【目的】利用干酪乳酸菌作为抗原传递系统来刺激机体产生黏膜免疫反应,从而研制有效的黏膜疫苗预防ETECF41的感染。【方法】重组菌在MRS培养基中进行表达,经SDS-PAGE、Western blot检测目的蛋白的表达,间接免疫荧光分析及流式细胞术检测外源蛋白展示到菌体表面。将重组菌及空质粒菌株分别滴鼻接种SPF级Balb/c小鼠,采集血液样品测定小鼠产生抗F41的特异性IgG,收集小鼠肺部冲洗液、肠道冲洗液、阴道冲洗液及粪便样品测定小鼠产生抗F41的特异性sIgA,并对小鼠进行攻毒保护性试验。【结果】重组干酪乳杆菌pLA-F41/L.casei免疫小鼠能够产生明显的抗F41的sIgA和IgG抗...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘朋 徐宏军 王麒文 王永恒 董婷婷 杨倩
[目的]通过给母猪口服表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的重组枯草芽胞杆菌以评估其产生的乳源性免疫力,从而为仔猪提供相应的保护。[方法]分别给母猪口服2 mL重组枯草芽胞杆菌(1×10~9 CFU·mL~(-1))和肌肉注射2 mL灭活PEDV疫苗(1×10~7 TCID_(50)·mL~(-1)),产后1 d收集相应的样品。首先检测了乳汁中特异性SIgA及乳汁细胞中特异性IgA,然后对口腔和鼻腔分泌物中特异性SIgA和细胞因子(INF-γ和TGF-α)的水平进行了检测;最后评估乳汁中的中和抗体滴度。[结果]口服重组枯草芽胞杆菌后乳汁中SIgA及其乳汁细胞中IgA特异性抗体水平显著提高(P<0.05,P<0.01),同时乳汁及其乳汁细胞中INF-γ和TGF-α的水平也显著提高(P<0.05,P<0.01);鼻腔和口腔分泌物中特异性SIgA显著增加(P<0.05,P
[期刊] 西南农业学报
[作者]
臧科伟 张春玲 邹勇 柴家前 崔言顺
含有猪细小病毒结果蛋白VP2基因的重组质粒pET32c-VP2,转入表达宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,重组VP2蛋白高效表达,以包涵体形式存在,经变、复性和纯化后,Western blot显示有良好的生物活性。纯化后的重组蛋白作为抗原,包被酶标板,建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为3.1μg/mL;血清最佳稀释度为1∶100,阳性标准初步定为OD待检血清≥0.4且OD待检血清/OD标准阴性值≥2.1。
关键词：
猪细小病毒 VP2基因 ELISA
[期刊] 华北农学报
[作者]
肖治军 张改平 杨汉春 杨艳艳 赵东 李学伍 邓瑞广 柴书军 邢广旭 杨继飞
为检测Ⅰ型IBDVVP2蛋白线性B细胞抗原表位肽PJ14和PJ5的免疫原性,将人工合成并纯化的PJ14和PJ5分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联;将与BSA偶联的PJ14和PJ5分别免疫BALB/c小鼠,然后以与OVA偶联的PJ14和PJ5作为间接酶联免疫吸附试验抗原,分别测定免疫鼠血清中抗相应多肽的抗体。结果显示,免疫小鼠产生了抗PJ14和PJ5的抗体,抗体持续期达21周。表明PJ14和PJ5具有免疫原性。
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