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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙永科 杨玉艾 王养会 李普华 张彦明
用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
涂亦娴 张馨玉 金华利 杨福 刘明羽 张富春 王宾
比较猪瘟病毒E2基因的真核表达质粒proVAX-E2n和pVP22-E2n体外表达效率以及体内的免疫效果,以从中选出高效的猪瘟病毒核酸疫苗。将上述表达载体转染Hela细胞进行体外表达后,用RT-PCR和间接ELISA法检测Hela细胞体内和体外表达产物;免疫6~8周龄昆明白小鼠,用间接ELISA法和MTS法检测小鼠血清中CSFV特异性IgG抗体水平以及脾脏中淋巴细胞增殖功能。结果表明2种E2重组质粒均能在Hela细胞中正确表达,且proVAX-E2n的E2蛋白表达量(OD值为0.575 4)明显高于pVP22-E2n(OD值为0.306 05)(P<0.05);proVAX-E2n刺激机体产生...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐璐 范学政 王琴 蒋春燕 宁宜宝 王泰健
目的对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达,以期获得可溶性表达产物,为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。方法用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD,A1A2,B和C。分别将4个片段克隆于pMAL-p2X载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21-CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中,共得到16株重组表达菌,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。结果E2基因的4个主要抗原结构...
关键词：
猪瘟病毒 E2基因 抗原结构域原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
程晓盈 张彦明 王(韦华) 邢福珊 郭抗抗 洪海霞
利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。
关键词：
猪瘟病毒石门株 E2基因 克隆 表达
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邱元 黄复深 陈尔曼 郝知友 袁鑫
为探讨粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对猪瘟病毒E2基因核酸疫苗小鼠免疫应答诱导的影响,将CSFVE2基因和GM-CSF片段插入真核表达载体pcDNA3.0内构建pcE2,pcE2-GF及pcGF核酸疫苗.动物试验时,50只雌性供试小鼠随机分为5组,即pcE2,pcE2-GF,pcDNA3.0,pcGF,生理盐水组,每组10只.0,2,4周于小鼠左后肢胫前肌进行肌注免疫,质粒量为每只每次50μg.每次免疫前和末次免疫后2周尾静脉采血收集血清,ELISA检测血清内特异性IgG水平.末次免疫后1周每组随机选3只无菌取脾,MTT法检测淋巴细胞增殖情况.结果表明,与对照组比较,pcE2和p...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
顾玲 王强 郑月茂 安志兴 马利兵 张涌
为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马秋明 张建安 王强 朱小甫 王文江 何维明
根据GenBank公布的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)Shimen株全基因序列,设计并合成2对引物,用RT-PCR方法对采自陕西省部分地区的30份CSF病料中,CSFV流行毒株的E2基因进行了扩增,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α。提取pMD-18T-E2重组质粒,进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与HCLV疫苗株和shimen株E2基因及E2蛋白进行序列分析。结果表明,从30份病料中共扩增到10株CSFV流行毒株的E2基因;扩增的10株陕西CSFV流行毒株E2基因同源性为92.3%~9...
关键词：
猪瘟 流行毒株 E2基因 序列分析
[期刊] 中国农业科学
[作者]
展小过 乔传玲 杨焕良 陈艳 孔维 辛晓光 陈化兰
【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴旭锦 朱小甫 徐德乾 杨萍 程养善 文耀武 鲁万民 乔志博 熊忙利
【目的】分析目前陕西省猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的E0、E2全基因分子特征,为猪瘟防控提供参考。【方法】根据CSFV Shimen株及HCLV株全基因序列,设计并合成了4对引物,采用RT-PCR方法,从采自陕西不同地区的猪瘟病料中扩增E0、E2全基因并进行序列测定分析。【结果】从采集的病料中成功扩增了5株猪瘟流行毒株的E0、E2全基因,这5株流行毒株E0基因核苷酸同源性在94.4%～99.8%,与参考毒株ALD、Alfort187、Bres-cia、CAP、Glentorf、GPE、GXWZ02、HCLV、Paderborn、Rimes和Shimen的核苷酸同源性在80.4%～96.3%,氨...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
童超 陈宁 廖迅 袁雪梅 李肖梁 方维焕
【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗,但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高,因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗,为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上,拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2,并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热,兔脾脏肿大;重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少,在接种后第12天检测到一过性的病毒血症;对接种猪血清检测结果表...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
魏中锋 张彦明 孙裴 张永国 洪海霞 倪斌 郭抗抗
根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒主要囊膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNAstar软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株核苷酸序列的同源性为99.4%,氨基酸序列的同源性为99.0%;细胞毒与标准石门株核苷酸序列的同源性为98.3%,氨基酸序列的同源性为96.7%。由此说明,猪瘟病毒经猪体多次传代和组织培养致细胞病变后,均能保持遗传的稳定性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐学清 曹瑞兵 蔡梅红 任雪枫 周斌 陈溥言
对含猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因插入的重组酵母菌株进行诱导表达,通过对诱导时间、重组酵母菌株、菌体密度、培养液pH、甲醇剂量等培养条件与表达产量关系的分析,对重组蛋白的表达条件进行了优化。优化后的条件为:28～30℃,225r/min振荡培养至BMGY中菌体OD600值为3.0～3.5时,将菌体转入相当于4倍体积BMGY,pH为6.0的BMMY培养基中培养72h,每24h加入甲醇至终浓度为总体积的0.5%～1.0%。在此优化条件下,重组蛋白的表达量可达275.38μg/mL,比较温度对重组蛋白降解率的影响后发现,培养物上清液应保存于-20℃。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵晓云 乔绪稳 陈瑾 李鹏成 于晓明 朱国强 郑其升 侯继波
【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达ＰＣＶ２ｂ亚型ＯＲＦ２基因，利用重组ＣａＰ蛋白制备ＰＣＶ２ ＶＬＰ疫苗的可行性。【方法】根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成ＰＣＶ２ ＮＪ株ＯＲＦ２基因，将其插入原核表达载体Ｐ ＱＺ１，鉴定阳性后转入表达宿主菌ｂＬ２１，利用原核表达平台ＣＶＣ１１０２对重组菌进行诱导表达。利用ＳＤＳ－ＰａＧＥ与ＷＥＳｔＥＲＮ ｂＬＯｔｔｉＮＧ对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析；利用电镜分析技术鉴定重组ＣａＰ蛋白ＶＬＰ组装；利用ｂＣａ试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量，利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比，得出目的蛋白量，将重组ＣａＰ蛋白的浓度调整为１ ｍＧ·ｍ Ｌ－１．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵晓云 乔绪稳 陈瑾 李鹏成 于晓明 朱国强 郑其升 侯继波
【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg.mL-1。使...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
陈果亮 余兴龙
将猪瘟病毒弱毒C株ST细胞苗以不同剂量(106 TCID50和105 TCID50)免疫28日龄仔猪,通过临床症状观察、病理剖检和组织病理学观察、抗体检测、特异性淋巴细胞增殖试验及抗原检测等方法评价疫苗免疫效果。结果表明:该疫苗接种仔猪后无任何临床症状,无病毒血症,无排毒现象;不同剂量免疫组,在2免后10 d左右猪瘟特异性抗体阳转,抗体水平于2免后20 d左右达到峰值。以上结果表明,猪瘟弱毒疫苗毒株C株的ST细胞传代疫苗对仔猪安全有效。
关键词：
猪瘟病毒 C株 ST细胞 免疫效果
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