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[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁军涛 陈晓宇 骆学农 王颖 张少华 刘斌 郑亚东 景志忠 才学鹏
【目的】构建表达猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原的重组鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。【方法】克隆并改造TSOL18基因,构建重组质粒pYA3341-TSOL18,电转入鼠伤寒沙门氏菌终宿主菌株X4550,体外鉴定重组菌X4550(pYA3341-TSOL18)表达蛋白的免疫原性、稳定性、生长曲线、安全性和小鼠免疫试验进行评价。【结果】酶切鉴定和基因序列测定证实重组质粒构建成功;尿素-SDS-PAGE检测有目的蛋白条带,Western Blot证实该抗原具有免疫原性;重组菌株在体外营养选择压力下可稳定地携带重组质粒传代繁殖;蛋白的表达对重组菌株的生长基本没有影响;小鼠实验证实重组菌安全可靠,二免后E...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
唐雨德 顾志香 雷永红 翟春生 刘玉 郁兴明
重组蛋白的复性是基因工程下游研究的难题和重点。本文应用夹心 ELISA 测免疫活性及变性与非变性 SDS-PAGE 测重组抗原单体和非单体的方法来评价不同复性条件.透析法复性,透析液为含2mg·kg~(-1)尿素、80μmol/PEG4000,0.1/0.1mmol·L~(-1)GSH/GSSG 的 pH 8.0的0.05mg·kg~(-1)PB,以静置缓慢透析为佳,上述条件任意缺一或快速透析,免疫活性下降,二聚体或多聚体明显增加;稀释法复性,复性液为上
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘永杰 郝艳红 李庆章
采用 12种培养体系培养猪带绦虫六钩蚴 ,结果发现单层细胞且无气相存在的培养体系效果较好 ,促使大部分六钩蚴进入了六钩蚴后期发育 ,且虫体可延长存活至 16d。
关键词：
猪带绦虫六钩蚴 体外培养 单层细胞
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙晓林 才学鹏 米晓云 陈怀涛
【目的】观察猪带绦虫虫卵和六钩蚴膜的超微结构。【方法】猪带绦虫病患者用槟榔、南瓜籽法驱虫,收集成熟虫卵。次氯酸钠法破壳后,等渗percoll溶液收集六钩蚴,人工肠液激活六钩蚴。扫描电镜和透射电镜观察虫卵和六钩蚴。【结果】猪带绦虫成熟虫卵呈卵圆形,直径约为50-58μm,由胚膜、内胞质层、六钩蚴膜和六钩蚴等几部分组成;发育期猪带绦虫六钩蚴的膜结构由外向内分别是外胞膜残留层、外胞质层(包括不规则较致密的外层和均质透明的内层)、胚膜(包括胚层和内胞质层)和六钩蚴膜,而成熟六钩蚴的膜结构仅六钩蚴膜一层,厚度约为49-51nm。【结论】猪带绦虫虫卵和六钩蚴膜的超微结构和缩小膜壳绦虫(Hymenolepi...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩进欢 苟惠天 尚清炎 孙晓林
【目的】明确重组蛋白pGEX-TPO18的免疫保护效果。【方法】提取豆状带绦虫六钩蚴RNA,根据带科其他种属绦虫18 kD基因的保守区设计引物,5′端分别引入EcoR I、Xho I限制性酶切位点,RT-PCR扩增,产物克隆于pMD18-T中进行序列测定,并对序列进行生物信息学分析。将纯化后的PCR产物和质粒pGEX-4T-1分别用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,连接后转化至E.coli BL21感受态细胞,挑斑摇菌,通过PCR方法和重组质粒测序技术进行鉴定,将鉴定正确的重组表达质粒命名为pGEX-TPO18。用IPTG诱导表达重组质粒,收集菌体进行SDS-PAGE分析,用GST琼脂...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王秋霞 张美英 张改平 王选年 宁长申 鲁琨 张龙现 菅复春
研究了培养基、温度、诱导时间I、PTG和氨苄青霉素终浓度以及诱导前后温度变化等不同条件对重组菌菌体生长和融合蛋白表达量的影响,以期获得猪囊尾蚴排泄分泌抗原(ES Ag)Ts8B1蛋白基因在大肠杆菌中的最大表达量。结果显示,使用TB培养基于37℃培养3 h后,采用终浓度为0.2mmol/L的IPTG和200mmol/L的氨苄青霉素在32℃过夜诱导培养,pGEX-6p-1/Ts8B1融合蛋白表达量最大,表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的33%。SDS-PAGE表明pGEX-6p-1/Ts8B1融合蛋白大小约为33 kDa,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与猪囊尾蚴多克隆抗体...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
古努尔·吐尔逊 米晓云 张壮志 石保新 吐尔洪·依米提 金映红 张妹 程小波 张旭 赵莉 张文宝
【目的】探索细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性。【方法】细粒棘球绦虫成虫虫体冻融产物,经蛋白酶K消化,离心上清作为粗提表膜糖抗原,SDS-PAGE鉴定糖抗原成分,硫酸-蒽酮法测定多糖浓度,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测免疫小鼠抗血清抗体效价和特异性以及确定抗原在虫体组织中的位置。【结果】SDS-PAGE图谱显示无蛋白条带出现,表明成虫膜蛋白被蛋白酶K完全降解;制备的糖抗原浓度为2.54mg.mL-1,初步确定为糖抗原。ELISA结果显示,随着免疫次数增加,抗血清中特异性抗体(IgG、IgM和IgA)效价也随之升高。与阴性血清相比,IgG、IgM和IgA的P/N值分别为4...
关键词：
细粒棘球绦虫 表膜糖抗原 抗血清
[期刊] 中国农业科学
[作者]
姜永萍 张洪波 步志高 李呈军 赵有淑 王秀荣 于康震 陈化兰
目的将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白,随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果间...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
肖旭倩 胡正龙 沈文涛 言普 王冬梅 周鹏
【目的】获得含有A/O型FMDV多抗原表位融合基因4种不同组合的转基因柱花草植株。【方法】用限制性内切酶Xba I和Sac I双酶切4个中间载体和质粒pBI121,回收连接后获得4个重组植物表达载体(pBI-xsB/xs T/xsBT/xsBTT)及相应农杆菌工程菌株,利用农杆菌介导法转化热研2号柱花草(Stylosanthes guianensis cv.ReyanⅡ)子叶叶盘。采用卡那霉素筛选,特异引物和转基因检测引物进行PCR及RT-PCR检测不同组合多抗原表位融合基因的转录情况。【结果】获得36株抗性转化株,经PCR检测有16株为阳性,RT-PCR检测后有11株为阳性,表明4种组合多抗原表位融合基因在转基因植株中获得转录。【结论】此研究为进一步揭示同型与异型FMDV之间多抗原表位基因不同融合方式的免疫原性和免疫效果奠定了研究基础。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
王振东 孙仓
将引起人类腹泻主要病原物小球状病毒(Small round structured virus;SRSV)编码抗原蛋白基因的全长序列1605bp,导入来自三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus;ClYVV)侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pClYVV/CP/W基因组的NIb/CP基因之间,构建了重组病毒克隆pClYVV-NV1.6。用上述重组病毒克隆接种蚕豆植物,表现了与野生型ClYVV相同的症状。从发病叶中提取总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)对上述重组病毒克隆的转录进行了检测,结果表明,外源基因在F4子代病毒基因组中仍然稳定存在。从发病叶中提取总...
关键词：
植物病毒载体 小球状病毒 抗原蛋白 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳乐军 梁卓玲 黄真池 沙月娥 曾富华
【目的】构建aiiA基因的原核表达载体，并进行诱导表达，检测aiiA蛋白的抗病性，为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】 从pMD-TM-19-T Vector＋aiiA质粒中酶切获得aiiA基因，将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1＋aiiA，经双酶切及测序鉴定后，进行诱导表达，并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明，重组原核表达载体pGEX-4T-1＋aiiA构建成功。表达条件优化结果表明，在25 ℃下用0.2 mmol/L IPTG诱导9 h，aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明，...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳乐军 梁卓玲 黄真池 沙月娥 曾富华
【目的】构建aiiA基因的原核表达载体,并进行诱导表达,检测aiiA蛋白的抗病性,为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】从pMDTM19-T Vector+aiiA质粒中酶切获得aiiA基因,将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA,经双酶切及测序鉴定后,进行诱导表达,并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明,重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA构建成功。表达条件优化结果表明,在25℃下用0.2mmol/L IPTG诱导9h,aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明,其能够降解细...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李军 吕长荣 窦琳 窦忠英
【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达,以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据Gene Bank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板,经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化TGⅠ大肠杆菌,筛选阳性克隆,其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘峰 曹雅琴 张学文 李良勇 邓晶 郭清泉
通过RT-PCR获得UDPGDH cDNA序列,经酶切、连接,以pET-32a为原核表达载体,构建成pET-32a-UDPGDH重组表达载体.经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化表达受体菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后表达出1个约53 000的蛋白,与推测的UDPGDH编码产物的大小一致.凝胶成像分析表明,最高表达量可占菌体总蛋白的47.1%,表明UDPGDH重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李桂伟 乔薪瑗 刘伯臣 马广鹏 刘敏 刘力威 李一经
【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性...
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