目的构建蜡梅花cDNA文库,分析蜡梅脂转移蛋白基因的表达,为探索蜡梅冬季开花分子机理,分离克隆特色基因奠定基础。方法以蜡梅花器官为材料,用SMART cDNA Library Construction Kit构建文库,RT-PCR分析基因表达。结果经测定原始文库滴度达到1.4×106 pfu/ml,扩增总文库滴度约为1010pfu/ml,重组率达到96%,插入片段在0.5 kb以上,平均约1.1 kb,通过PCR检测,从总文库中检测到了表达丰度不同的蜡梅PI、AP3和LTP基因的特异片段,说明所构建的文库覆盖度高、代表性强,LTP基因具有内含子,而总文库中扩增出的LTP基因不含内含子,说明所构...

建立了辣椒疫霉侵染的辣椒幼苗cDNA文库,该原始文库含有1.5×106个独立克隆,插入片段约为0.5-2 kb.采用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从该cDNA文库中筛选出了1个应答辣椒疫霉侵染的候选基因的全长cDNA.经生物信息学分析,推测这个候选基因为非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid-transfer protein,nsLTP)基因.

以果梅品种'细叶青'不同时期的花和果实为实验材料,应用Creator SMART cDNA Construction Kit构建了我国果梅第一个花和果实的cDNA文库。结果表明,该文库的库容量约为1.4×106pfumL,从扩增文库中随机挑取30个克隆进行PCR鉴定,其重组率达97%,插入片段多分布在1～3kb之间,平均大于1kb。说明本研究成功构建了果梅花和果实的cDNA文库,为进一步开展果梅开花调控和果实发育等相关基因的克隆及其表达与功能分析等研究奠定了重要基础。

应用cDNA-SRAP标记方法,筛选出19对引物,对8-12月所采集的24个蜡梅花芽(花朵)样品所制备的cDNA模板进行扩增,研究蜡梅花发育各时期的基因表达情况,并对部分差异片段进行了表达分析和功能预测。结果表明,cDNA-SRAP分子标记技术操作简便,能产生较丰富的条带,是进行差异显示分析研究的有效途径;与玉米淀粉去分支酶基因、欧洲山杨纤维素合成酶基因、玉米抗锈病基因和小麦多酚氧化酶基因相似性高的差异表达片段,可能对蜡梅花发育和抗性表现起着重要的作用。

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

通过显微注射的方法,将绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因注射入花鲈(Lateolabraxjaponicus)单细胞期受精卵动物极细胞质内。初步研究了显微注射后的花鲈胚胎的存活状况。在荧光显微镜下观察到了GFP的表达,多数胚胎表现为嵌合性表达。利用PCR技术,从花鲈尾芽期胚胎DNA中扩增出了特异片段,大小为750bp,表明显微注射胚胎中整合了外源GFP基因。

利用cDNA-AFLP分析籼稻明恢86应答稻纵卷叶螟取食基因差异表达,发现1个与植物同源结构域(PHD)锌指蛋白高度同源的TDF,分离获得该TDF对应的粳稻全长cDNA.该全长cDNA与籼稻、玉米、蓖麻、葡萄、拟南芥和大豆等作物PHD锌指蛋白推定氨基酸序列的同源性分别为98.43%、86.01%、54.58%、57.02%、57.51%和55.88%.荧光定量PCR研究表明,日本晴(粳稻)叶片中该基因的表达也受稻纵卷叶螟取食的诱导,推测该基因与籼稻和粳稻应答稻纵卷叶螟取食密切相关.

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到HSP90,采用基因克隆方法获得含有1个97bp的5’UTR、2190bp的开放阅读框和501bp的3’UTR的全长cDNA序列。整个开放阅读框编码729个氨基酸,包含HSP90家族5个保守信号区。与其他物种已知序列同源比对的结果显示,此编码氨基酸更接近于热休克蛋白90β亚型(HSP90β),与牙鲆HSP90β的同源性高达96.6%。RT-PCR分析表明,在胚胎发育初期就能检测到HSP90,其表达量伴随着胚胎发育,先增加后减少,在尾芽期达到最高。HSP90在健康大菱鲆各供试组织中均有表达。经鳗弧菌感染处理后,在胚胎细胞中也有HSP90的强烈表达。结果显示,大菱鲆...

为促进肉食性鱼类人工配合饲料开发的理论基础研究,分析鱼类脂肪代谢的机制,实验克隆了大口黑鲈2个脂蛋白脂肪酶基因LPLtype1和LPLtype2的cDNA。序列分析表明,LPLtype1基因cDNA序列全长2 156 bp,编码516个氨基酸;LPLtype2基因cDNA序列全长1 710 bp,编码346个氨基酸。大口黑鲈LPLtype2与LPLtype1氨基酸序列之间的同源性为43.5%。系统进化分析表明,大口黑鲈LPLtype1和鳜LPL聚为一支,大口黑鲈LPLtype2和大麻哈鱼LPLtype2紧密聚为一支。预测分析发现,大口黑鲈LPLtype1和LPLtype2基因编码蛋白的活性中心...

利用SMART技术构建了北京油鸡肝脏全长cDNA文库,构建的未扩增文库滴度为1.96×106pfu·mL-1,文库重组率为92.8%,插入片段长度为1.23kb,扩增文库滴度为1.64×1010pfu·mL-1。设计purH基因保守引物对该文库进行筛选,克隆了北京油鸡purH基因(GenBank登录号:EU334506),将purH基因完整开放阅读框定向插入pEGFP-N3,构建带有GFP报告基因重组表达载体pEGFP-N3-purH,将其导入北京油鸡体外培养细胞中。转染后24、48和72h,pEGFP-N3-purH转染率为10.3%～53.2%,绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中。随表达量...

【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo(dT)引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU·ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank...

以木本油料植物油桐为研究对象,通过预实验选择种子成熟过程中脂肪酸转变关键时期,构建油桐种仁cDNA文库,并进行部分测序。初级文库的滴度为1×106pfu.mL-1,重组率为99.7%,插入片段大小为0.5~2.5 kb,平均约1 kb。通过测序获得的功能基因类型主要包括抗性基因、油体蛋白基因、贮藏蛋白基因及种子发育相关基因等,还有大量的未知功能基因和其他基因存在,各类基因的表达丰度不一。着重对首次分离到的油桐油体蛋白oleosin基因序列进行了同源性和蛋白结构预测分析。

【目的】鉴定西花蓟马（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）气味结合蛋白（ｏｄｏｒａｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｂｐ）并对其序列特征及分布情况进行研究，为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用ｒｔ－ｐｃｒ和ｒａｃｅ技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因，用ｄｎａＭａｎ软件进行序列分析，用ｂｌａｓｔ进行同源性比较，并用Ｍｅｇａ６．０的邻接法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）构建系统进化树，应用服务器ｃｈｏｕ＆ＦａｓＭａｎ预测蛋白的二级结构，通过实时荧光定量ｐｃｒ检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克．．．

应用RACE技术克隆了脊尾白虾血蓝蛋白基因全长cDNA序列,并对该序列进行了分析。结果显示,该基因全长2158bp,开放式阅读框长1992bp,5’非编码区长26bp,3’非编码区长140bp,将该基因命名为EcHc。EcHc编码663个氨基酸,前15个氨基酸组成信号肽,推测成熟肽的分子量为75.05kDa。Blast比对结果显示,由脊尾白虾血蓝蛋白cDNA序列推导的氨基酸序列与日本沼虾、信号小龙虾血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别为86%、68%,由此推断该cDNA序列可能属于血蓝蛋白家族。利用Real-timePCR方法,分别研究了鳗弧菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染脊尾白虾后,肝胰腺组织中...

利用抑制消减杂交技术构建了潮间带绿藻孔石莼(Ulva pertusa)在干出胁迫状态下上调表达基因的消减cDNA文库。获得的阳性克隆经测序得到150条上调表达的EST片段,其中21条为冗余序列(RS),137条非冗余序列(NRS)。片段中最长833 bp,最短106 bp,平均长度364 bp。参与比对的EST片段按照其注释功能可分类为:细胞生长与发育、蛋白合成与分解、代谢过程、胁迫应答、光合作用与光诱导、转录调节、信号转导等相关基因。未知功能和无对比结果序列共60条,占非冗余序列的43.80%。比对相似度主要分布在20%~60%之间,主要与已经完成基因组测序的藻类或高等植物的氨基酸序列具有较...