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[期刊] 华北农学报
[作者]
毛玉梅 李琴 付鸣佳 金华燕 沈俊良 钟雪晴
为了探讨蛹虫草类枯草杆菌蛋白酶（ＳｕｂｔｉｌｉＳｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａＳｅ）的表达特性，以真菌蛹虫草菌丝体为研究对象，通过ｒｔ－ｐＣｒ获得蛹虫草Ｃｍｋｅｘｉｎ基因的ｏｒＦ序列，并进行序列分析。应用ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐＣｒ方法，检测蓝光照射后蛹虫草菌丝体中Ｃｍｋｅｘｉｎ基因的转录情况。结果获得蛹虫草Ｃｍｋｅｘｉｎ基因的ｏｒＦ序列。对翻译蛋白质产物Ｃｍｋｅｘｉｎ进行生物信息学分析，表明该蛋白质含１个属蛋白转化酶的肽酶Ｓ８家族功能域（１４３～４２９）和１个前体蛋白转化酶ｐ功能域（５１４～６００），符合真菌类枯草杆菌蛋白酶的特征。蛹虫草菌丝体在黑暗预培养４ ｄ后再蓝光照射．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
钟雪晴 叶德晓 毛玉梅 付鸣佳 杨志海
生物体中接受蓝光信号的因子为蓝光受体蛋白。为了揭示蓝光受体蛋白在蛹虫草中的存在形式,将蛹虫草蓝光受体基因Cmwc-1和Cmwc-2的部分序列构建在原核表达载体p ET-41a(+)中,在大肠杆菌中进行表达。以所表达的融合蛋白作抗原制备抗体,并由Western Blotting对蛹虫草菌丝体和子实体分别进行分析检测。结果表明,获得了高效价的蛹虫草蓝光受体蛋白Cm WC-1和Cm WC-2的抗体。经过Western Blotting分析,在蛹虫草菌丝体和子实体中检测到Cm WC-1有42 ku (Cm WC1-42)和48 ku (Cm WC1-48) 2种蛋白质存在形式,其中在菌丝体中主要以Cm WC1-48为主,Cm WC1-42的相对量较少;而在子实体中主要以Cm WC1-42为主,没有检测到Cm WC1-48。在菌丝体和子实体中检测到Cm WC-2有相同的50 ku(Cm WC2-50)蛋白质存在形式。结果表明,在Cm WC-1和Cm WC-2复合物行使生物功能过程中,Cm WC-1在菌丝体和子实体中分别产生了差异性降解,而Cm WC-2维持稳定。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
丛斌 张明珠 胡志凤 段立佳 王晓静 张统书 董辉
为克隆米蛾［ＣｏｒＣｙｒａ ＣｅｐｈａｌｏｎｉＣａ（Ｓｔａｉｎｔｏｎ）］β－ａＣｔｉｎ基因ＣＤｎａ片段，建立米蛾β－ａＣｔｉｎ基因实时荧光定量ｐＣｒ（ｑｒｔ－ｐＣｒ）方法，并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性，利用反转录ｐＣｒ（ｒｔ－ｐＣｒ）技术克隆获得米蛾β－ａＣｔｉｎ基因ＣＤｎａ片段，采用ＳｙＢｒ ＧｒｅｅｎⅠ染料法建立ｑｒｔ－ｐＣｒ方法，检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫４个虫态中β－ａＣｔｉｎ基因的表达量。获得了长为８２２Ｂｐ的米蛾β－ａＣｔｉｎ基因片段（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ａＣＣｅＳＳｉｏｎ：ｋＪ５９９５６９），编码２７３个氨基酸残基；荧光定量标准曲线的Ｃｔ值检测范围为１３～２８．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李晶 林雄杰 何静敏 蔡璨 林占熺
为探讨牛樟芝子实体和不同培养时期的菌丝体中三萜含量及鲨烯环氧酶基因（Ｓｅ）和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因（Ｍｖｄ）的表达情况，采用香草醛－冰醋酸法测定菌丝体和子实体的三萜含量，并利用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析甲羟戊酸途径（ＭｖＡ）中Ｓｅ和Ｍｖｄ基因表达水平。结果表明，随着培养时间的推移，当生长至２１ ｄ时牛樟芝菌丝体干重逐渐趋于稳定。当培养时间小于２８ ｄ时，菌丝体中三萜含量随着培养时间的延长而逐渐增加，且２８ ｄ时菌丝体的三萜含量最高，达（３９．１９２±２．０２５）Ｍｇ／ｇ，仅次于牛樟芝子实体三萜含量（４９．３９１±２．６７５）Ｍｇ／ｇ，玉米芯栽培的牛樟芝子实体三萜含量最低，为（１．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李琴 毛玉梅 付鸣佳 沈俊良 金华燕 钟雪晴
采用ＲＴ–ＰＣＲ克隆蛹虫草中蓝光受体基因ＣｍｗＣ–１和ＣｍｗＣ–２。结果表明，ＣｍｗＣ–２基因序列的翻译产物Ｃｍ ｗＣ–２中存在１个ＰＡＳ结构域和１个锌指结构域。实时荧光定量ＰＣＲ结果显示，蛹虫草菌丝体ＣｍｗＣ–１和ＣｍｗＣ–２基因的表达量分别在蓝光照射后６ ｈ和２ ｈ达到峰值。子实体形成不同阶段ＣｍｗＣ–１和ＣｍｗＣ–２的相对转录量都有较大差异，生长５０ ｄ时蛹虫草子实体不同部位的ＣｍｗＣ–１表达主要在子实体的中下段，ＣｍｗＣ–２的表达主要在子实体的顶端和中段，畸形子实体中ＣｍｗＣ–１和ＣｍｗＣ–２的表达量都不高。
[期刊] 华北农学报
[作者]
姚梦瑶 李娟 刘志刚 蔡大润 李晓荣 李波 杨洋 王子轩 王勇攀 陈勋基 耿洪伟 陈果
盐碱胁迫已成为制约我国农业生产的重要因素之一，探索农作物耐盐分子机理，对作物育种具有重要的理论价值和实际应用价值。旨在克隆玉米中的ZmMPI基因，转化玉米植株。首先通过qRT-PCR对盐碱溶液处理下植株中的ZmMPI表达量变化进行分析，之后利用DNAMAN软件对ZmMPI蛋白序列进行多重比较分析同时利用MEGA 7.0软件构建系统发生树，并利用一系列软件对ZmMPI进行生物信息学分析。最后利用分子克隆技术，成功克隆ZmMPI基因的编码序列，构建植物过表达载体并利用农杆菌介导的遗传转化方法转化玉米自交系B104,在基因组水平、转录水平以及蛋白质水平对过表达转基因植株鉴定，分析其表达量变化。结果表明，ZmMPI基因的表达量受盐碱胁迫后整体呈现出先上升后下调的趋势；ZmMPI蛋白序列比较结果相似率为64.15%,系统发生树显示，ZmMPI与玉米(小颖大刍草亚种) ABA34115.1同源性最高，该蛋白含有一个蛋白结构域Potato＿inhibit,有α螺旋结构、无规则卷曲结构和β转角结构，偏疏水性，预测潜在的磷酸化位点有10个；对获得的49个转化事件鉴定结果显示，其中有13个过表达转基因株系中的ZmMPI基因在基因组水平能正常表达，有10个过表达转基因株系中的ZmMPI基因能正常转录、翻译。最终获得10个能够正常转录翻译的过表达转基因株系，为进一步探究ZmMPI基因响应盐碱胁迫的分子机制奠定基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈善真 李春玲 贾爱卿 王贵平
【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)外膜蛋白P5(outer-membrane protein P5,OMP5),建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。【方法】克隆扩增HPS OMP5基因,并将OMP5基因与原核表达载体pET-32a(+)连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。亲和层析法纯化蛋白,尿素梯度透析复性,Western blot鉴定表达产物。将超声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其它条件进行优化...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张洪波 杨宏军 葛利江 何洪彬 杨少华 王长法 高运东 仲跻峰
【目的】克隆金黄色葡萄球菌血浆凝固酶(Coa)基因,并在大肠杆菌中进行融合表达,分析重组蛋白的生物活性。【方法】用PCR法扩增金黄色葡萄球菌Coa基因,构建Coa基因原核表达载体pET32a(+)/coa,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平;将重组蛋白纯化后,测定其血浆凝固效价。【结果】扩增出了2 106 bp的Coa基因,其包含1个完整的开放阅读框,编码含701个氨基酸的成熟多肽;IPTG诱导后该基因表达的融合蛋白分子质量为100 ku,目的蛋白产量占菌体总蛋白的13%;纯化的重组蛋白含量为0.047 mg/mL,其对兔血浆凝固效价为0....
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
车勇良 陈如敬 江斌 王隆柏 魏宏 吴学敏 庄向生 周伦江
采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌(Hps)的寡肽结合蛋白(Opp A)基因,序列测定结果表明,扩增片段全长1654 bp.将扩增片段插入表达载体p GEX-6P-1中,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组融合蛋白大小约为87 ku,以纯化的重组蛋白Opp A作为抗原,建立Hps抗体的间接ELISA检测方法.通过试验确定最佳的反应条件为:抗原包被浓度为1.0μg·孔-1,于37℃包被1 h,待检血清的稀释度为1∶50,阳性判断标准(D450 nm)大于0.643.特异性和重复性试验结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和稳定性,可用于Hps抗体的检测.
[期刊] 西南农业学报
[作者]
雷帮星 何劲 文庭池 何珺 康冀川
建立了用超声波法提取蛹草拟青霉中虫草菌素和用HPLC法测定其含量的方法。试验结果表明,在检测波长259 nm处,虫草菌素浓度为5.42~173.3μg/mL时,回归方程C=-1.2846+3.41192×10-5A,r=0.9996;平均回收率100.15%,RSD=0.54%(n=4);超声波法提取菌丝体中虫草菌素时,提取溶剂以水或低于20%浓度的乙醇溶液较好,提取时间30m in;用此法可测定不同蛹虫草菌株中虫草菌素的产量。
关键词：
蛹草拟青霉 虫草菌素 高效液相色谱法
[期刊] 水产学报
[作者]
孙君君 卢荣华 杨峰 秦超彬 杨丽萍 王俊丽 孔祥会 李学军 聂国兴
固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是调控糖脂代谢相关基因表达的关键核转录因子。为获知草鱼SREBP-1基因的序列及其在肝脏中的表达规律,本实验采用同源克隆和RACE方法获得了草鱼SREBP-1基因的部分cDNA序列,并通过生物信息学方法对该基因及所编码蛋白的结构特征进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术,对SREBP-1基因在8种不同组织的表达规律及低糖(糖含量24%)和高糖(糖含量42%)投喂条件下肝脏中的表达水平进行了研究。结果显示,所克隆到的草鱼SREBP-1基因cDNA长4 760 bp,其中包括开放读码框3 426bp,编码1 141个氨基酸;草鱼SREBP-1具有一个典型的碱性螺...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
耿丽娟 何莉莉 鄂玉洋 刘狄 王淑杰 佟贤 韩成玲
研究了蛹虫草菌种在不同条件下保藏对其菌丝生长和产量的影响,以寻求适宜的菌种保藏条件。采用10℃/5℃(昼/夜)和15℃/10℃两种变温条件、散射光和黑暗两种光照条件,分别保藏菌种30d和60d的时间,以冰箱(4℃)保藏为对照。结果表明:10℃/5℃保藏时,蛹虫草的菌丝生长和子实体产量优于15℃/10℃及对照保藏;散射光保藏菌落颜色和菌丝气生性及子实体产量好于黑暗保藏;在10℃/5℃温度下,保藏时间对菌丝生长和子实体产量影响不大,可以继续延长保藏时间,在15℃/10℃温度下,不宜超过60d的保藏时间。因此,较适宜的保藏条件是10℃/5℃、散射光、保藏30d,菌株表现为菌落边缘整齐,菌丝气生性中等...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
闫硕 朱家林 朱威龙 潘李隆 张青文 刘小侠
【目的】克隆及序列分析棉铃虫(Helicoverpa armigera)α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因(HeTubA),采用荧光定量PCR(QRT-PCR)技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因(GenBank登录号为JQ069957)。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王婧 李冰 刘翠翠 夏吉鹏 张继瑜
【目的】顶质体是存在于包括疟原虫和巴贝斯虫在内的顶复门寄生虫的一种细胞器,在病原体中,它主要承载类异戊二烯前体和脂肪酸合成途径,异戊二烯五碳结构是有机体合成多种化合物的结构基础,对有机体生命活动至关重要,例如,在哺乳动物中成为胆固醇和类固醇激素的基本结构,在植物中参与合成类胡萝卜素。且存在于顶质体的类异戊二烯前体合成途径对于病原体的生命活动至关重要且不存在于人类和哺乳动物机体,这使其成为近年来人们研究抗原虫药物的焦点。有学者发现利用特异性阻断类异戊二烯代谢途径的药物可治疗疟疾。1-脱氧-5-磷酸D-木酮糖合成酶(DXS)为该途径中的第一个限速酶。因此,针对牛巴贝斯虫的1-脱氧-5-磷酸D-木酮...
关键词：
牛巴贝斯 DXS 序列分析 真核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨雪清 张雅林
【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67b...
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