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[期刊] 水产学报
[作者]
王国良 刘璐 李思源
根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感...
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈利达 袁军海 李磊 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚
为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。
关键词：
镰孢菌 实时荧光定量PCR 湿度 病残体
[期刊] 水产学报
[作者]
荣小军 廖梅杰 张正 王印庚 刘智超 李彬 王岚 陈贵平
根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在T m为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x+39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,3个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。研究表明,所建立的实...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵丽 赵绪永 陈红英 崔保安
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试...
[期刊] 水产学报
[作者]
曹泽艺 周庆杰 陈凯 习丙文 谢骏 潘良坤 毛颖
为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
刘宗晓 刘荭 史秀杰 高隆英 岳志芹 吕建强 何俊强 江育林 谢从新
选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张小敏 周斌 何丹妮 庞然 赵津 陈溥言
根据GenBank中的猪源抗病毒蛋白Mx1基因(poMx1)序列设计1对特异性引物,从Mx1基因全长片段中扩增和克隆了特异性的115 bp核苷酸片段。测序鉴定正确后将重组质粒进行定量并10倍倍比稀释作为扩增模板,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,建立Mx1的标准曲线及回归方程。结果显示:该标准曲线的回归方程为Y=-2.986 3 lg X+38.239 3(R2=0.998 5),灵敏度为1×102μL-1;应用该方法对猪瘟兔化弱毒苗接种猪肾细胞(PK-15)后产生的poMx1 mRNA进行定量分析,发现病毒感染细胞4 h后,poMx1的表达量最高(P<0.01),然后随着时间...
关键词：
猪源Mx1 实时荧光定量PCR 标准曲线
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹伟伟 郭抗抗 许信刚 宁蓬勃 刘伟 程敏 董玲娟 徐磊 高婉俊 任敏
【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
吴绍强 李海艳 林祥梅 郑腾 李西峰 刘建 梅琳 韩雪清 贾广乐
选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。
关键词：
派琴虫 贝类 实时荧光PCR 检测
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周云雷 魏飞龙 李健 张小华 蒋红霞
【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
万春和 陈翠腾 傅秋玲 程龙飞 傅光华 陈红梅 施少华 黄瑜
【目的】建立禽坦布苏病毒（ＡｖｉＡｎ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＡＴｍｖ）ＴＡｑｍＡｎ实时荧光定量ＰＣｒ检测方法。【方法】根据ＡＴｍｖ非结构蛋白ｎｓ１的基因特征，设计特异性的引物和探针，建立基于ＴＡｑｍＡｎ探针检测ＡＴｍｖ的实时荧光定量ＰＣｒ检测方法，对其特异性、重复性进行检测。用建立的ＴＡｑｍＡｎ实时荧光定量ＰＣｒ检测方法和之前建立的ｒＴ－ＰＣｒ方法同时对临床１５份疑似ＡＴｍｖ感染的病料进行检测，计算其符合率。【结果】成功建立了检测ＡＴｍｖ的实时荧光定量ＰＣｒ检测方法，当ｎｓ１基因含量为（２．６７×１０２）～（２．６７×１０７）拷贝／μＬ时有良好的线性扩增，其扩增相关系数为０．９９８，扩增．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋月 程琨 梁秀丽 王亚宾 付彤 韩立强 魏战勇
为了建立绿脓杆菌的SYBR Green I实时定量PCR检测方法,以便更加快捷、方便的检测绿脓杆菌,根据16S rDNA高度保守的特性,在绿脓杆菌16S rDNA保守区设计1对引物,利用普通PCR技术扩增出绿脓杆菌16S rDNA保守区277 bp的片段,并克隆到pMD-18 T载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了绿脓杆菌的荧光定量PCR检测方法。并对方法的灵敏性、特异性、重复性进行评价,又进一步在临床实践中进行检验。结果显示,所建立的方法对标准样品的最小检出浓度为28拷贝/μL。并且特异性检验结果显示与常见的菌群没有交叉反应,重复性良好...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
朱致翔 时浩杰 雷飞斌 张传清
由茶麋子葡萄座腔菌Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ引起的山核桃Ｃａｒｙａ Ｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ干腐病是山核桃栽培过程中的主要病害，该病菌表现明显的＂潜伏侵染＂特性。研究山核桃树体中干腐病菌的定量检测技术对山核桃干腐病的预测预报及科学防治具有重要的指导意义。根据茶麋子葡萄座腔菌的ｅＦ１α基因设计特异性引物，通过普通聚合酶链式反应（ｐＣｒ）和实时荧光定量ｐＣｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐＣｒ）扩增发现引物ｅＦｒｔ－Ｆ１／ｒ１对山核桃干腐病病菌的特异性及扩增效率较高，可稳定扩增出２３０ Ｂｐ的目标条带。应用此特异性引物建立的实时荧光定量ｐＣｒ干腐病病菌检测方法能够定量检测出山核桃植株样品．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
林强 李宁求 付小哲 刘礼辉 石存斌 吴淑勤
以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180 CFU/mL。同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%。结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测。
关键词：
副溶血弧菌 荧光定量PCR toxR基因
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
拜廷阳 杨增岐 吴志明 普志平 赵明军 闫若潜
【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性...
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