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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘珍 张庆利 万晓媛 马芳 黄倢
根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中公布的虾肝肠胞虫（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ）（ｅｈｐ）ＳＳＵ ｒ Ｄｎａ序列设计１对特异性引物，建立并优化了ｅｈｐ的ＳｙＢｒ Ｇｒｅｅｎ ｉ实时荧光定量ｐｃｒ（ｑ ｐｃｒ）检测方法。结果显示，该方法在６０℃的退火温度时扩增效果最好，产物的熔解曲线为１个单峰，构建的方法对８．３×１０１–８．３×１０８ ｃｏｐｉｅＳ／μｌ的ｅｈｐ ＳＳＵ ｒ Ｄｎａ片段的检测响应具有良好的线性关系，扩增产物阈值循环数（ｃｔ）与模板起始量的对数［ｌｏＧ（Ｓｑ）］的关系为ｃｔ＝–３．３６９ ｌｏＧ（Ｓｑ）＋３９．３６４（ｒ２＝０．９９２），扩增效率为９８．１％，检测．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
宋增磊 董宣 赵若恒 王秀华 武和英 于党辉 谢国驷 黄倢
对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样,采用TaqManqPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量,再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样,检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度,定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性,比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明,检测灵敏度过低,会降低高并样率检测的准确性;阳性率在30%以上时,高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好;高载量感染的阳性率不低于6.7%时,50∶1以内的并样能准确得出检测结果;低载量感染的阳性率不低于16%时,25∶1以内的并样能得出较好结果;高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果;各种并样模式均有很好的诊断特异性,50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近;各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27～2.83范围,二者存在极显著相关性,各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘雅梅 邱亮 程东远 张庆利 万晓媛 黄倢
对采自天津、浙江和山东等养殖场5个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体的442尾个体进行虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的Taq Man探针荧光定量PCR检测,并测量各群体每尾对虾的生物学体长和体重。引入医学上的劳累尔(Rohrer)体重指数(Ponderal index,PI,W/L3)关系建立对虾体重(W)和体长(L)关系函数。结果显示,4个凡纳滨对虾的EHP阳性群体[平均体长为(5.37±1.19)cm]的体重指数PI平均值为(5.1
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
宁梓健 姜宏波 刘琦 包杰
分泌蛋白是在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质，其在许多原生动物寄生虫操纵宿主细胞和影响虫体的毒力中起着重要作用。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是一种可感染多种经济虾类的专性细胞内寄生虫，是近年来影响全球对虾养殖生产较严重的病害之一。本文利用真核生物分泌蛋白预测流程EuSecPred2.0对EHP全基因组的分泌蛋白进行预测，并对分泌蛋白长度、信号肽长度、切割位点处氨基酸分布等信息进行分析，对分泌蛋白功能进行分析。结果表明，分泌蛋白氨基酸长度主要集中在30～400 aa之间；信号肽长度集中在9～32 aa之间；信号肽切割位点处以疏水性氨基酸为主。对信号肽进行基序分析，发现存在基序NV[VT][IK]CA[ED][SA]。对所获蛋白质进行功能注释，发现了多种与微孢子虫黏附侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白。研究结果有助于了解EHP对宿主的侵染机制，同时为进一步明确EHP的致病相关因子提供理论依据。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘宝彬 杨冰 吕秀旺 万晓媛 刘珍 黄倢
[期刊] 水产学报
[作者]
曹泽艺 周庆杰 陈凯 习丙文 谢骏 潘良坤 毛颖
为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
吴绍强 李海艳 林祥梅 郑腾 李西峰 刘建 梅琳 韩雪清 贾广乐
选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。
关键词：
派琴虫 贝类 实时荧光PCR 检测
[期刊] 中国水产科学
[作者]
乔毅 沈辉 万夕和 范贤平 蒋葛 黎慧 王李宝 史文军 成婕
为了研究江苏地区感染南美白对虾(Penaeus vannamei)的肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)的形态学特点,分析与国外报道的差异性,本研究以江苏地区感染肝肠胞虫的南美白对虾肝胰腺组织为研究材料,通过蔗糖密度梯度离心等方法进行肝肠胞虫初步分离纯化,构建一种肝肠胞虫荧光染色检测方法,显微观察肝肠胞虫的孢子形态结构。结果发现感染江苏地区南美白对虾的肝肠胞虫孢子主要分布在35%~40%浓度的蔗糖层面,可推算其密度为1.15~1.17 g/m L。荧光显微镜下可见孢子椭圆或圆形,呈亮蓝色,孢子微小但可计数,显微观察可见肝肠胞虫孢子大小约为1.7μm×0.9μm,外壁上有大量白色瘤状物,疑似胞壁蛋白,孢子表面布满细小褶皱,孢子具有一个细胞核,极丝4~6圈,细胞壁由一相对薄的电子透亮的孢子内壁和电子致密的孢子外壁组成。结论认为江苏地区南美白对虾肝肠胞虫的形态结构与国外报道的吻合,本研究建立的肝肠胞虫分离纯化、荧光染色方法以及取得的肝肠胞虫形态学资料可为其检测和研究提供参考。
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
刘宗晓 刘荭 史秀杰 高隆英 岳志芹 吕建强 何俊强 江育林 谢从新
选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
谢丽基 谢芝勋 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤
根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测单孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫的检测敏感性达到40拷贝数,比常规PCR敏感性高100倍;对派琴虫、折光马尔太虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果全为阴性。表明该研究建立的单孢子虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床单孢子虫感染的快速检测。
关键词：
贝类 单孢子虫 荧光定量PCR 检测
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
段健诚 胡吉卉 沈宇航 邓高威 高威 牟华 张庆起 高焕
为探究虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei， EHP)感染对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)肠道菌群的影响，本研究基于16S rRNA基因的测序结果，对感染EHP的脊尾白虾肠道菌群进行了分析。结果显示，感染虾与健康虾肠道菌群差异较大，且其肠道菌群结构多样性显著低于健康虾。研究发现，病虾中归属于变形菌门(Proteobacteria)的脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、未分类蓝细菌科(unidentified＿Cyanobacteria)、支原体科(Mycoplasmataceae)和未分类α变形菌科(unidentified＿Alphaproteobacteria)为优势菌，而归属于厚壁菌门(Firmicutes)的乳杆菌科(Lactobacillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)及噬几丁质杆菌科(Chitinophagaceae)细菌在健康虾中占据优势地位。EHP侵蚀导致感染虾肠道内潜在致病菌显著增加(P<0.05)，增加了其他疾病的易感性。此外，通过Tax4Fun功能预测，发现感染虾肠道菌群主要用于新陈代谢，从而抵抗EHP侵染，维持机体正常功能；健康虾肠道菌群则多用于个体生长与环境信息处理，进而保证生长与存活。本研究从虾肠道菌群结构方面入手，进一步探究了EHP感染对脊尾白虾肠道菌群的影响，以期为EHP的防治提供帮助。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘飞 张宝存 张晓华 黄倢
本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对...
[期刊] 水产学报
[作者]
李媛媛 蔡生力 刘红
卵黄磷蛋白作为卵黄蛋白的主要成分,可为甲壳动物胚胎和早期幼体发育提供能量,为研究其来源及合成规律,实验应用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法检测了凡纳滨对虾和罗氏沼虾性腺不同发育时期卵巢和肝胰腺两种组织中卵黄蛋白原mRNA的表达水平。结果发现,凡纳滨对虾和罗氏沼虾的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达。随着卵巢的发育,凡纳滨对虾卵巢中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前5个阶段不断增加,分别为1.1,5.9,10.4,26.9,85.0,恢复期急剧减少,为1.6。肝胰腺中的相对表达量也不断增加,分别为1.3,3.3,7.1,37.3,51.6,恢复期急剧减少,为1.0。罗氏沼虾肝胰腺中...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
姜娓娓 李秋芬 刘淮德 李晓龙
利用GyrB基因的特异性引物建立沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法。将已知浓度的气单胞菌菌液加入灭菌的沉积物样品中,作为模拟沉积物样品。通过选择和优化沉积物DNA提取方法、特异性引物、标准曲线模板,建立沉积环境中气单胞菌属细菌准确检验的实时荧光定量PCR方法,同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明,采用改进的溶菌酶-SDS温和裂解法提取沉积物DNA,以扩增GyrB基因片段的IAF和IAR为特异性引物,并直接以模拟沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线,可以建立适用于定量检测沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
程翔 蔡生力 刘红 李媛媛
中国明对虾卵黄蛋白原mRNA基因在卵巢和肝胰腺中都有表达。采用实时荧光定量PCR方法测定在卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺这两种组织的卵黄蛋白原mRNA的表达水平,提取组织总RNA,设计特异性引物进行荧光定量PCR扩增,对卵巢发育的各个阶段,卵原细胞增殖期、卵黄发生前期、初级卵黄发生期、次级卵黄发生期和消退期的卵黄蛋白原mRNA表达进行相对定量分析。结果表明:在卵巢中,卵黄蛋白原mRNA在前3个阶段随着卵巢的发育,表达量不断增加,分别为0.04、0.23和1.03,次级卵黄发生期开始减少到0.16,消退期卵黄蛋白原mRNA表达量又增加到1.00。而在肝胰腺,前4个阶段随着卵巢发育,表达量逐步增加,...
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