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[期刊] 华北农学报
[作者]
张飞燕 王振华 潘康成 唐慧琴 谷笑笑 李伟
旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张蕾 李新生 崔保安 陈红英 孙凯 宋亚鹏
根据GenBank基因库中HLA-A胞外区成熟肽基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从健康人血液中扩增HLA-A胞外区基因,扩增产物进行T-A克隆、测序.结果表明,获得的HLA-A胞外区基因大小为819bp,与模板序列的同源性为96%.利用基因重组技术,将HLA-A胞外区基因亚克隆入pET-21a(+)载体中.经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET–21/HLA-A中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET–21/HLA-A.
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
陈大玮 邓利 何凡 邱聪龄 马一见 刘志刚
以简并引物通过RT-PCR从重要经济海水鱼类棕点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus白细胞中扩增出一条388bp具有完整编码框的cDNA序列。Blast分析初步显示,该序列属于鱼类抗菌肽Piscidin家族的一员,将其命名为棕点石斑鱼Piscidin样肽(GU592793),推导氨基酸序列具有界定鱼类Piscidin的以下共同特征:(1)预测的信号肽序列与其他Piscidin的同源性较高,在60%~95%之间;(2)推测的成熟肽N端6个氨基酸残基富含Phe、Ile及His;(3)成熟肽第8个和第13个氨基酸位点均为Gly。NJ进化树分析表明,该cDNA推导的氨基酸序列与赤点...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李彬 毛立 何孔旺 温立斌 茅爱华 张雪寒 倪艳秀 郭容利 马俊杰 周俊明 吕立新 俞正玉
猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为46 kDa的融合蛋白,蛋白表达量较高,而且蛋白以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western Blot结果显示,表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应,表明原核表达的NP1蛋白具有良...
关键词：
猪博卡病毒 NP1基因 克隆 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
袁志栋 王志亮 刘雨田 吴晓东 赵永刚 刘海生
目的克隆、分析水牛朊蛋白(prionprotein,PrP)成熟片段基因,并获取纯化的表达产物。方法将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a,并分析其序列;把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3),鉴定纯化的表达产物。结果水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上,并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列,编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后,用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活...
关键词：
水牛成熟PrP 克隆 序列分析 原核表达
[期刊] 农业现代化研究
[作者]
傅德智 孔祥峰 杨焕胜 褚武英 李铁军 印遇龙
兴奋性氨基酸转运载体EAAC1是肠道内谷氨酸的主要载体。本研究根据人的基因编码区设计一对特异性引物,以藏猪空肠总RNA为模板,通过RT-PCR获得一长约1600 bp的cDNA片段,T/A克隆后测序,并进行序列分析;将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。测序结果显示,获得的cDNA全长为1575 bp,编码524个氨基酸;EAAC1分子量为57 kD,等电点为5.34,GenBank登录号为GQ375513;该蛋白质具有3个N-糖基化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点和1个cAMP/cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张志远 张继希 徐红运 刘肖萍 卢晓艳 段二珍 夏平安 崔保安
应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杜丽丽 樊爽爽 李赛赛 陈佩格 陈磊 孙士平 樊文杰 王江 王月影 钟凯
【目的】环磷酸鸟苷－腺苷酸合成酶（ｃｙｃｌｉｃ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｃ ｇａｓ）是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶，能够识别胞质ｄｎａ，催化ａｔｐ和ｇｔｐ生成第二信使ｃ ｇａｍｐ，继而通过ｓｔｉｎｇ依赖的方式活化转录因子ｉＲＦ３，启动机体固有免疫。通过构建含猪ｃ ｇａｓ基因的重组质粒ｐ ＢＢ Ｂ３ａ－ｈｉｓ６－ｎｕｓ ａ－ｃ ｇａｓ，进行原核表达，得到ｃ ｇａｓ蛋白，为进行体外催化合成ｃ ｇａｍｐ及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏ｃ ｄｎａ为模板克隆猪ｃ ｇａｓ的蛋白．．．
关键词：
猪cGAS 非酶连接 丙酸诱导 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孟星宇 李婷 李沐 刘宁 田玉华 胡薇
【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Ros...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
程晓盈 张彦明 王(韦华) 邢福珊 郭抗抗 洪海霞
利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。
关键词：
猪瘟病毒石门株 E2基因 克隆 表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
谢立兰 安康 陈力 孙紫德 方六荣
DEAD-box解旋酶21(DEx D-box helicase 21,DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成员之一,不仅参与RNA的合成和加工过程,同时还参与机体的天然免疫应答,调控病毒的复制。为了研究猪DDX21基因的结构和功能,以猪肾传代细胞(PK-15)总cDNA为模板,根据GenBank公布的预测序列(XM_005657387.2)设计引物扩增猪源DDX21基因,并采用分子生物学软件将其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,首次成功克隆了猪DDX21基因的cDNA序列(Ge
[期刊] 华北农学报
[作者]
方剑玉 朱文豪 李海利 郭小参 白献晓 王克领
为研究猪Viperin蛋白在猪体内的抗病毒活性,用IFN-α刺激PK-15细胞24 h,收集细胞提取RNA后,采用RT-PCR方法扩增猪Viperin基因,并连接至p EASY-blunt simple平末端连接测序载体,PCR鉴定后送公司测序正确。采用DNAStar分析猪Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,选取抗原性较好的一段基因,采用PCR扩增后,插入pET-28a+大肠杆菌表达载体,在37℃条件下用IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析证明,Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达,包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗式佐剂进行乳化后颈背部皮下注射9日龄的BALB/c小鼠,14 d后加强免疫一次,收集小鼠血清。采用Western Blot、IFA鉴定制备多克隆抗体的特异性,该多克隆抗体可以和阳性sViperin真核表达载体pCI-sVIP等表达的猪源Viperin蛋白进行特异性反应。试验成功克隆了猪Viperin基因,并制备了良好Viperin蛋白的多克隆抗体。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王亚男 梁岩岩 严文培 张银萍 李强 吴秀菊
为进一步挖掘甲基丁香酚合成相关酶基因，解析北细辛次生代谢途径，根据北细辛转录组数据库信息，筛选和克隆了AhOMT1基因，并进行了相应的生物信息学分析及原核表达分析。结果表明，AhOMT1基因包含的开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸，理论分子质量为40.23 ku,等电点为5.34,AhOMT1蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构，无信号肽序列；AhOMT1基因具有二聚化结构域与甲基转移酶结构域，AhOMT1与催化类黄酮、丁香酚类化合物的O-甲基转移酶的同源性较高；构建pET-32b-AhOMT1原核表达载体，成功诱导表达约60 ku的重组蛋白；确定了最佳诱导条件是0.2 mmol/L IPTG,16℃诱导16 h,该诱导条件下的重组蛋白多以可溶性蛋白形式存在；使用Ni~(2+)树脂分离纯化AhOMT1蛋白，以200 mmol/L咪唑洗脱可得到最大量的蛋白。该研究首次克隆了北细辛AhOMT1基因，构建原核表达载体，筛选出AhOMT1蛋白最佳诱导条件。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 杨志军 王群 渡部终五
【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(N...
[期刊] 水产学报
[作者]
陈圣毅 刘新富 徐永江 刘芝亮 柳学周 史宝 王妍妍
应用RT-PCR方法扩增七带石斑鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ(esIGF-Ⅰ)成熟肽序列。该成熟肽序列由210个碱基组成,编码70个氨基酸,包括B-C-A-D 4个结构域。将此成熟肽片段导入原核表达载体pET-28a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小为11 ku,在IPTG诱导后3 h表达量最高,占菌体总蛋白的51.8%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。对重组蛋白进行变性、纯化和复性,获得了纯化的重组蛋白。Western-blotting免疫印迹分析表明,融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。细胞增殖实验表明,纯化的IGF-Ⅰ...
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