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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
宋廷宇 侯喜林 吴春燕 何启伟 霍雨猛
以薹菜品种京研薹菜叶片cDNA为模板,采用RT-PCR技术,获得了编码薹菜CYP79B5基因全序列1 847 bp,包含有1 620 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸。以薹菜基因组DNA为模板,获得了2 112 bp的目的片段。经比对发现其氨基酸序列与油菜、白芥、拟南芥等CYP79B5编码的氨基酸序列具有较高同源性,与油菜同源性达100%。经过生物信息学分析,发现所推导的氨基酸序列具有明显的CYP蛋白信号域,且可以在SWISS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构。扩增CYP79B5完整的编码区序列,构建pET-24α(+)重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导融...
关键词：
薹菜 CYP79B5 基因克隆 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
杨亚男 黄辉洋 黄小帅 叶海辉 李少菁
采用RACE技术,克隆了近缘新对虾cyclin B基因,该序列全长1 667 bp,编码区1 209bp共编码402个氨基酸,所推导的氨基酸序列N端不存在信号肽。BLAST比对后发现,其氨基酸序列与刀额新对虾的同源性达90%。经RT-PCR检测,cyclin B基因在近缘新对虾的卵巢和肌肉中表达水平最高,胸神经节和心脏次之,鳃、眼柄神经节、肝胰腺几乎没有表达。推测主要与cyclin B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关。原核表达结果显示,pET32a表达载体在0.2 mmol/L IPTG、25℃诱导4 h条件下可得到纯度较高的分子量约67 ku的蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
邓淑贞 王斌 高磊 牛倩雅 刘涛 翁曼丽 郭宝太
以叶状体总DNA为模板,用3对DNA引物进行PCR扩增,获得了坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PhTPS)3个重叠的片段,大小分别为1.3,1.1,0.7 kb。用pMD18-T载体克隆这些片段,经测序与序列拼接获得了该基因完整的ORF序列,其长度为2 727 bp。在已经构建条斑紫菜TPS基因原核表达载体pET22b-PyTPS的基础上,用PhTPS基因替代该表达载体中的PyTPS基因,获得了PhTPS基因的原核表达载体pET22b-PhTPS。重组菌BL21(pET22b-PhTPS)经IPTG诱导,SDS-PAGE显示获得了约100 kDa的特异性蛋白条带;目测及OD600的测定结果表明...
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭兆来 白学贵 李昆志 徐慧妮
亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)在生物体中调控信号分子一氧化氮(NO)的代谢和平衡。为了深入研究GSNOR的功能,利用RT-PCR和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术从菠菜根中克隆了SoGSNOR基因的全长序列,该基因编码框1 140 bp,编码379个氨基酸,GenBank登录号为KR381778。将其克隆到原核表达载体pET32a上,构建原核表达载体pET32a-SoGSNOR,并转化大肠杆菌
关键词：
S-亚硝基谷胱甘肽还原酶 原核表达 菠菜
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡向阳 屈新运 吴格格 秦苗苗 刘蕊 高天娥 李焘
为了探究菘蓝IiCYP79B2基因的结构、特性和功能,对菘蓝IiCYP79B2基因进行了克隆,并进一步开展了生物信息学分析和不同条件下的表达模式研究。相关研究结果显示:IiCYP79B2基因全长1 827 bp,包含1个内含子,ORF全长1 629 bp,编码542个氨基酸。其编码的蛋白含有2个跨膜结构域,无信号肽,定位于叶绿体类囊体膜上,属于主要由无规则卷曲和α-螺旋构成的亲水性蛋白,与白芥的亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明:IiCYP79B2基因在菘蓝各组织中的表达量由高到低依次为叶>茎>果>花>根,在不同发育时期的表达量依次为营养生长期>花期>幼苗期>萌芽期;此外,该基因的表达还显著响应茉莉酸甲酯(MJ)和葡萄糖(Glu)信号的诱导,受到水杨酸(SA)和低温(Cold)胁迫的抑制。相关研究结果为进一步探讨IiCYP79B2基因的功能提供了有效的试验依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
杨志刚 姚琴琴 成永旭 施秋燕 杨青 何杰 马明君 王瑶 常东
根据已登录的中华绒螯蟹一种Δ６去饱和酶基因（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＪＸ９４６４３４）及菁夜蛾去饱和酶基因（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＫＪ６２２０５５．１）的保守区设计引物，通过逆转录Ｐｃｒ以及ｒＡｃｅ技术克隆了中华绒螯蟹另一种Δ６去饱和酶基因ＦＡＤ６－ｂ的全长序列。经序列分析，中华绒螯蟹ＦＡＤ６－ｂ ｃＤｎＡ全长为２ ３１０ ｂＰ，其中开放阅读框（ｏｒＦ）为１ ３２６ ｂＰ，共编码４４２个氨基酸（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＫＰ８７６０５８），理论分子量为５０．８６ Ｋｕ，理论等电点为８．４７，ＦＡＤ６－ｂ基因的氨基酸序列与已公布的一条中华绒螯蟹Δ６去饱和酶基因的一致．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李晓梅 陈永 李珣 钟国华
利用RT-PCR和RACE技术,以小菜蛾(Plutella xylostella)3龄幼虫的cDNA为模板,克隆获得泛素延伸蛋白基因Px-ubi(GenBank No.FJ527489),核苷酸序列全长537 bp,其中开放阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子质量为16.7 ku,等电点为9.1,与已知真核生物泛素延伸蛋白的同源性为92%～98%。RT-PCR结果显示Px-ubi在小菜蛾不同生长发育时期均有表达,其中卵期、3龄期和预蛹期含量较高,而成虫期含量较低。同源建模显示,Px-ubi的3D结构主要由1个α螺旋、4个β折叠以及β转角和不规则卷曲组成,4个β折叠两两反向平...
关键词：
小菜蛾 泛素 基因 克隆 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
周麟 李拓键 屈燕
为探究尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)在不同花色绿绒蒿中的序列特征及其与绿绒蒿花色的关系，以黄色花的全缘叶绿绒蒿和红色花的红花绿绒蒿为研究材料，从2种花色绿绒蒿的全长转录组数据中各筛选1个UGT基因，根据转录组KEGG注释结果，将这2个基因分别命名为MiUGT79B1和MpUGT79B1,并对其进行克隆、生物信息学及RT-qPCR分析。结果表明：MiUGT79B1和MpUGT79B1基因ORF长度为1 314,编码437个氨基酸。MiUGT79B1和MpUGT79B1蛋白的结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，属于亲水性稳定蛋白。系统进化树和多序列比对分析发现，MiUGT79B1和MpUGT79B1与鸦片罂粟、火罂粟、野罂粟和博落回的亲缘关系最近。RT-qPCR分析显示，MiUGT79B1和MpUGT79B1均在花蕾期高表达，MiUGT79B1表达趋势为先降低后升高，MpUGT79B1表达趋势为先降低后保持平缓。2种花色绿绒蒿UGT基因表达水平与总黄酮累积模式均呈显著正相关。结果为进一步深入研究MiUGT79B1和MpUGT79B1基因在绿绒蒿花瓣呈色中的功能及其花色分子育种提供理论基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁勇 常玮 刘小烛
【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李晨宇 足木热木·吐尔逊 李晓荣 杨洋 李波 于月华
MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用，而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值，因此，从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列，并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析，通过Gataway BP和LR反应，将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件，最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示，GhMYB42(XP＿016732693.1)全长序列1 508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸，预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现，MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域，是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示，陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP＿012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显，因此，选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37℃诱导3 h。Western Blot结果表明，重组蛋白的大小正确，最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白，后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
丛凡淏 赵金乔 刘毅 杨竞平 张林波
【目的】克隆人生长分化因子－１５（Ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔＨ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１５，Ｈｇｄｆ－１５）成熟肽基因，构建其原核表达载体，并进行诱导表达，为Ｈｇｄｆ－１５药理活性和生物学功能研究奠定基础。【方法】利用Ｐｃｒ技术克隆人Ｈｇｄｆ－１５成熟肽基因，将其连接到Ｐｅｔ－２８ａ载体上构建Ｐｅｔ－２８ａ－Ｈｇｄｆ－１５原核表达载体，并将此载体转入ｒｏｓｅｔｔａ（ｄｅ３）大肠杆菌感受态细胞，获得重组大肠杆菌，对目的蛋白分别采用不同温度（１６，２５，３７℃）、ｉＰｔｇ浓度（０．１０，０．２５，０．５０，０．７５，１．００ｍｍｏｌ／ｌ）和时间（１２，２４，３６，４８Ｈ）进行诱．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭亚格 刘佳隆 齐志颖 何雷 贾艳艳 陈建 陈松彪 廖成水 丁轲 余祖华
【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2 221)H_(3 451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1 320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王金苹 赵俊龙 江涛 周艳琴 刘琴 付媛 姚宝安
利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有免疫反应活性。为进一步进行弓形虫病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡薇 刘宁 田玉华 李雨婷 张连学
【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶(SQE)基因,并进行原核表达与纯化,初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。【方法】以4年生人参根组织须根为材料,提取其总RNA,反转录为cD-NA。以合成的cDNA为模板,对SQE基因进行克隆,再将其插入原核表达载体pET-30a中,构建pET-30a-SQE重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转入Rosetta大肠杆菌,经0.8mmol/L IPTG 37℃诱导表达4h后,进行SDS-PAGE电泳检测,采用Ni-Agarose亲和层析柱纯化目的蛋白,利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS)检测SQE的活性。【结果】获得了人参SQE基因1 ...
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人参 鲨烯环氧酶 cDNA克隆 原核表达
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