【目的】蓝莓休克病毒（ＢｌｕｅＢｅｒｒｙ ｓｈｏｃｋ ｖｉｒｕｓ，Ｂｌｓｈｖ）是蓝莓上主要病毒之一，侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于Ｂｌｓｈｖ快速检测的ｉｃ－ｒＴ－ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ技术，为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ已报道的Ｂｌｓｈｖ基因序列，设计一对外侧引物（Ｂｌｓｈｖ－Ｆ／Ｂｌｓｈｖ－ｒ）和一对内侧引物（Ｂｌｓｈｖ－１／Ｂｌｓｈｖ－２），以感染Ｂｌｓｈｖ的蓝莓病叶为材料，利用免疫ｉｃ－ｒＴ－Ｐｃｒ（免疫捕获ｒＴ－Ｐｃｒ）和ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ（巢式Ｐｃｒ）建立Ｂｌｓｈｖ的ｉｃ－ｒＴ－ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ检测技术；分别以Ｂｌｓｈｖ、蓝．．．

为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳...

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究。结果表明:以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA。设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带。构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%。用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据。

利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)技术从马铃薯病毒发病叶片中检测并克隆到PVX、PVY和PLRV3种病毒及其外壳蛋白基因的全长序列,长度分别为714、804和627 bp。结果表明,TC-RT-PCR技术是一种简单,快捷,灵敏度高的方法,在马铃薯病毒的检测和相关基因的克隆中将会得到很好的应用。

根据舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV)的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因(egt)设计一对特异性引物,成功建立了LdMNPV的PCR检测技术体系,其对LdMNPV基因组的灵敏度可达到1 fg.mL-1。应用该技术体系从舞毒蛾带毒幼虫、卵、蛹的基因组中扩增出目的片段,证明了这一技术的可行性。对不同浓度的多角体悬液的扩增结果显示:其检测最低量为5 OBs·mL-1。形态学研究表明:从内蒙舞毒蛾体内分离到的LdMNPV中,少数表面有凹陷的孔洞,病毒粒子从这些孔洞中游离出来,这也阐明了此技术能够从多角体悬液中扩增出目的片段的原因。在将来LdMNPV的检测中,可用虫体进行研磨过滤离心得到的组织液作...

[目的]建立乐都紫皮大蒜4种病毒的多重RT-PCR快速检测方法,为大蒜病毒病病原鉴定、脱毒效果验证等提供技术支撑。[方法]根据乐都紫皮大蒜RNA全长转录组测序结果,分别设计洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)、大蒜潜隐病毒(garlic latent virus,GLV)、大蒜D病毒(garlic virus D,GarVD)和大蒜X病毒(garlic virus X,GarVX)4种病毒的外壳蛋白特异性引物,筛选不同引物,优化引物用量、模板用量、退火温度等条件,并进行了多重RT-PCR的灵敏度检测和12份引进栽培大蒜种质资源的病毒检测。[结果]通过优化筛选,在一个PCR反应体系中实现了OYDV(1 232 bp)、GLV(831 bp)、GarVD(506 bp)和GarVX(116 bp)4种病毒的多重检测,最优反应条件为退火温度55℃,模板用量2.5μL,混合引物用量各1.0μL。多重RT-PCR的灵敏度略低于单一RTPCR。对引进的12份栽培大蒜资源进行4种病毒的多重RT-PCR检测发现,有5份资源存在4种病毒,4份资源存在2种病毒,3份资源存在1种病毒。对7份资源中经多重PCR未检测到的病毒,使用单一RT-PCR进行检测和验证发现,除1份内蒙古资源(NMG)的1种病毒(GarVX)外,多重RT-PCR结果与单一RT-PCR检测结果一致。[结论]本研究建立的大蒜多重RT-PCR体系可靠性强,可用于大蒜病毒的检测与防控。

为研究DsCPV在松毛虫种群中的垂直传递及对松毛虫灾害的持续控制作用 ,通过反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)建立了DsCPV的早期检测技术。依据家蚕质型多角体病毒 (BmCPV)质型多角体蛋白的核苷酸序列设计一对引物 ,从纯化的DsCPV、BmCPV和舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)的基因组dsRNA可成功地扩增出长 6 14bp的目的片段 ,从提取的健康松毛虫幼虫肠组织的DNA、舞毒蛾核型多角体病毒 (LdNPV)基因组核酸、以及棉铃虫质型多角体病毒 (HaCPV)基因组核酸 ,未能扩增出目的片段。DsCPV基因组dsRNA扩增片段的序列与BmCPV相应基因序列具有 87%的同源性...

【目的】建立3种大白菜病毒病多重RT-PCR检测技术,为病毒病快速检测、白菜病毒病防治与抗病育种提供参考。【方法】针对我国大白菜芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)3种病毒的外壳蛋白(CP)基因保守区序列,设计特异性检测引物,从多重RT-PCR(mRT-PCR)扩增引物、Mg(2+)浓度、Taq DNA聚合酶及dNTPs浓度、退火温度、延伸时间和

【目的】建立一种实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)的方法,用于测定田间植株样品及其传毒媒介烟粉虱(Bemesia tabaci)中To CV的含量。【方法】首先根据To CV次要外壳蛋白(minor coat protein,CPm)基因的保守区域序列,运用Primer 3.0在线软件设计To CV特异性检测引物To CVq F和To CVq R,并通过Primer-BLAST进行比对保证检测引物的特异性;其次分别以感染To CV、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的番茄样品为模板,应用该对引物进行To CV基因片段的克隆鉴定;将阳性克隆样品放入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养,并提取质粒,获得To CV质粒标准品,将To CV质粒标准品按10倍浓度梯度稀释,建立标准曲线;同样以按10倍浓度梯度稀释的To CV质粒标准品为模板,同时运用RT-q PCR和反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),比较这两种方法检测To CV的灵敏度;最后应用该方法对田间采集的8份疑似To CV感染的番茄样品以及获毒24 h后的单头烟粉虱进行病毒检测,结合扩增曲线、熔解曲线和Ct值对待测样品中的带毒情况和带毒量进行测定。【结果】在感染To CV的番茄样品和阳性对照中,引物To CVq F和To CVq R均能够特异扩增出To CV CPm基因片段,目的片段大小为230 bp,而在感染TYLCV、TSWV的番茄样品、健康番茄样品和空白对照中,该对引物则无法扩增出特异性目的条带,说明该对引物特异性较强;构建To CV的RT-q PCR标准曲线结果表明,随着To CV质粒标准品模板浓度逐渐降低,Ct值出现递增趋势,并且在质粒标准品浓度2.7×103—2.7×109 copies/μL范围内,To CV标准曲线Ct值同质粒标准品浓度之间呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,决定系数R2=0.9911,直线方程为y=-3.32×lgx+40.06(y代表循环阈值即Ct值,x代表质粒初始浓度),该曲线将用于To CV含量的测定。RT-q PCR灵敏度检测结果表明,该方法能够检测出的To CV质粒标准品最低浓度为2.7×103 copies/μL,而常规RT-PCR仅能够检测出2.7×105 copies/μL的病毒样品,通过RT-q PCR法检测To CV比常规RT-PCR法灵敏100倍。该方法能成功检测出田间植物样品携带To CV情况,8份疑似To CV感染的番茄样品中有6份携带To CV,同常规RT-PCR检测结果一致,结合标准曲线计算出感染To CV的番茄样品带毒量分别为2.48×105、2.21×105、7.97×104、3.74×107、3.37×107、2.78×106 copies/μL;烟粉虱获毒24 h后,携毒率为100%,单头烟粉虱最高带毒量为2.55×104 copies/μL,最低为6.46×102 copies/μL。【结论】建立的RT-q PCR检测To CV的方法特异性强、灵敏度高,可以实现植物样品和媒介昆虫携带To CV情况和病毒含量的检测,可为To CV的准确、有效监测和预警提供技术支持。

【目的】明确草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)的分子变异特点;探索利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV的方法。【方法】利用RT-PCR扩增SMoV3′非编码区(non-coding region,NCR)和大外壳蛋白(large coat protein,LCP)基因特异片段,并对扩增产物进行克隆测序。利用生物信息学软件分析不同地区分离物变异特点及系统发育关系。参考测序结果,在SMoV基因组保守区设计引物,利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV。【结果】获得了SMoV中国分离物的NCR区和部分LCP基因核酸序列,不同分离物部分LCP基因核酸序列同源性...

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.

　根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的诊断方法。结果表明,RT-nestedPCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此方法简单省时、灵敏性高,可以作为检测RNA病毒的一种分子生物学方法。

根据黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对,运用单重RT-PCR检测到病毒并筛选出适合多重RT-PCR的引物对。以唐菖蒲18S rRNA为内参照,建立同时检测CMV和TMV的多重RT-PCR方法。此方法可从带病样品中扩增出CMV(629bp)和TMV(423bp)2条特异片段。测序结果表明:CMV扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为93%～97%,TMV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达99%。

根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV特异性扩增片段435 bp,IHHNV特异性扩增片段301 bp和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0...

采用TR IZOL试剂盒和异硫氰酸胍法2种方法提取了带PVX马铃薯试管苗的总RNA。根据设计好的1对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的总RNA进行了体外扩增。结果表明,所用2种方法都能有效地提取马铃薯RNA,并适合于反转录合成病毒cDNA,得到了与预期大小相一致的720 bp片段,而对照未得到任何产物。但利用TR IZOL试剂盒进行RNA提取价格较贵,而异硫氰酸胍法所用试剂可自己配制,方法灵活,价格较TR IZOL试剂盒便宜。从而建立了经济简便的PVX RT-PCR检测体系,为PVX的防治、脱毒种薯和核心种苗的检测提供有效手段。