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[期刊] 西南农业学报
[作者]
孙茂 吴丽艳 龚亚菊 鲍锐 桂敏 黎志彬 杜光辉
【目的】克隆云南野生蒜芥茄（Solanum sisymbriifolium Lam.）中的FLS2基因，并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、系统进化以及表达情况予以分析，初步探究野茄FLS2基因在黄萎病胁迫下的生物学功能。【方法】基于前期所测转录组数据（蒜芥茄接种黄萎病病原菌），克隆获取蒜芥茄FLS2基因，命名为SsFLS2；利用生物信息学分析软件对SsFLS2基因的理化性质进行分析，并通过实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测其在蒜芥茄根、茎、叶的表达以及在接种黄萎病病原菌后不同时间的表达情况。【结果】蒜芥茄SsFLS2基因全长3655 bp，具有完整的ORF框，编码1126个氨基酸。其编码蛋白的分子式为C5596H8814N1494O1627S4，理论分子量为124.34 kD，理论等电点（pI）为7.33，总平均亲水性系数为0.081。该蛋白二级结构主要由42.81%的无规则卷曲、40.23%的α-螺旋、13.23%的延伸链以及3.73%的β-折叠组成，且存在跨膜结构，定位于细胞膜上，其中可被磷酸化且超过阈值线的位点，共计151个。SsFLS2蛋白的氨基酸序列与马铃薯（Solanum tuberosum）同源蛋白（XP 006358149.2）的关系最近。RT-qPCR检测发现，在蒜芥茄根、茎、叶中均有SsFLS2基因的表达，且根、叶中的相对表达量极显著高于茎部；接种黄萎病病原菌后72 h內，处理组和对照组均在24 h时，SsFLS2基因的相对表达量大幅度增加且极显著高于其他时间点。【结论】本研究成功克隆了蒜芥茄的SsFLS2基因，并对其编码蛋白的理化性质以及基因表达情况等进行了分析。结果表明，SsFLS2是蒜芥茄响应黄萎病胁迫的重要基因，结果将为进一步研究该基因在蒜芥茄黄萎病抗性中的功能奠定前期基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李志邈 杨悦俭 杨飞 叶青静 王荣青 阮美颖 周国治 姚祝平
目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
崔萌萌 孙亮 王灿磊 赵胜利 刘姝彤 许小茜 王艳萍 纪凯 李平 冷平
为了解ABA对果实发育和成熟的调控作用,对与ABA合成相关的LeNCED2基因进行了克隆与分析。采用RT-PCR和RACE技术从番茄品种‘嘉宝’(Solanum lycopersicum cv.Jiabao)果实中克隆得到了一个LeNCED1基因的同源片段,定名为LeNCED2(基因库注册号:EU912387)。该基因3′端序列为1635bp,与LeNCED1基因的DNA序列同源性为72.7%,与马铃薯中的StNCED2基因(AY662343)碱基序列同源性高达95%。碱基序列推导的蛋白序列与LeNCED1基因的同源性为80%。RT-PCR分析显示LeNCED2基因在番茄植株的根、茎、叶、花和...
[期刊] 华北农学报
[作者]
周倩怡 黄思杰 田洁
中性/碱性转化酶作为植物蔗糖代谢的关键酶，主要参与植物生长发育、逆境胁迫响应等过程。为探究大蒜AsNI对逆境胁迫的响应模式，以乐都紫皮大蒜为试验材料，克隆得到2个中性/碱性转化酶基因，并进行了生物信息学和表达特性分析。结果表明，AsNI1和AsNI2的开放阅读框分别为522,1 203 bp,编码173,400个氨基酸；AsNI1与AsNI2均为亲水性蛋白，预测定位于细胞质，具有Glyco＿hydro＿100结构域；但二者的氨基酸序列相似性仅为25.75%,AsNI2含有1个糖基化位点，而AsNI1未检测到糖基化位点，二者的亲缘关系较远。蛋白互作网络分析结果表明，AsNI2与AsNI1可能参与不同的生化过程。启动子序列分析发现，AsNI1和AsNI2的启动子区域含有多个与响应相关的顺式作用元件，其中AsNI2启动子的干旱和低温胁迫响应元件个数显著大于AsNI1。通过对启动子转录因子结合位点进行预测发现，二者含有不同种类及数量的结合位点，表明AsNI1和AsNI2可行使不同的基因功能。qRT-PCR检测发现，AsNI的表达具有明显的组织特异性，AsNI1和AsNI2分别在根和鳞茎中表达量最高。同时，逆境胁迫能够诱导AsNI表达，低温和干旱处理下均以AsNI2的响应程度强于AsNI1。其中，低温胁迫以诱导叶片AsNI2的表达为主，干旱胁迫以诱导根系AsNI2的表达为主。通过分析AsNI的序列特征和表达模式，验证了AsNI的抗逆功能。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘金梦 秦贝贝 黎航航 肖调义 苏建明
采用RT–PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus) II型小肽转运载体(PepT2)基因全长cDNA序列，对其进行生物信息学和共线性分析，并采用实时荧光定量PCR技术检测分析健康草鱼PepT2基因在不同组织中的表达情况。结果表明：草鱼PepT2基因的cDNA序列全长为2733 bp，包括开放阅读框2169 bp(编码722个氨基酸残基)，5′非编码区82 bp和3′非编码区482 bp；草鱼PepT2基因结构含有20个外显子和19个内含子；预测蛋白相对分子质量为8.032×10~(4)，等电点为6.01，该蛋白具有与哺乳动物同源蛋白类似的12个螺旋跨膜结构，并且在跨膜区9和10之间有1个大的外环，跨膜区氨基酸高度保守，含有6个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N–糖基化位点；预测的PepT2蛋白三级结构包含有18个α–螺旋和21个β–折叠；氨基酸序列同源性分析结果显示，草鱼PepT2氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高，为86.65%，与其他所比较的物种的同源性则为52.83%～68.15%；系统进化树分析表明，草鱼与斑马鱼的亲缘关系最近；与斑马鱼相比，草鱼PepT2所在的染色体保留着大多数基因，具有保守的基因块；实时荧光定量表达分析表明，草鱼PepT2在肠道中表达量最高，其次是肾脏。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘金梦 秦贝贝 黎航航 肖调义 苏建明
采用RT–PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus) II型小肽转运载体(PepT2)基因全长cDNA序列，对其进行生物信息学和共线性分析，并采用实时荧光定量PCR技术检测分析健康草鱼PepT2基因在不同组织中的表达情况。结果表明：草鱼PepT2基因的cDNA序列全长为2733 bp，包括开放阅读框2169 bp(编码722个氨基酸残基)，5′非编码区82 bp和3′非编码区482 bp；草鱼PepT2基因结构含有20个外显子和19个内含子；预测蛋白相对分子质量为8.032×10~(4)，等电点为6.01，该蛋白具有与哺乳动物同源蛋白类似的12个螺旋跨膜结构，并且在跨膜区9和10之间有1个大的外环，跨膜区氨基酸高度保守，含有6个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N–糖基化位点；预测的PepT2蛋白三级结构包含有18个α–螺旋和21个β–折叠；氨基酸序列同源性分析结果显示，草鱼PepT2氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高，为86.65%，与其他所比较的物种的同源性则为52.83%～68.15%；系统进化树分析表明，草鱼与斑马鱼的亲缘关系最近；与斑马鱼相比，草鱼PepT2所在的染色体保留着大多数基因，具有保守的基因块；实时荧光定量表达分析表明，草鱼PepT2在肠道中表达量最高，其次是肾脏。
[期刊] 华北农学报
[作者]
方彦 杨刚 孙万仓 曾秀存 武军艳 刘自刚 杨宁宁
为研究芸芥自交亲和机理，采用ｍＲＮＡ差异显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）分析技术，从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得１条差异片段。测序及ＤＮＡ序列的生物信息学分析表明，该差异片段与拟南芥ＤＮＡＪ蛋白同源基因ＡＴ Ｊ３有较高同源性，暂命名为ｅｓＡＴＪ３基因。该序列含有一个长度为２９７ ｂＰ的完整开放阅读框，编码９８个氨基酸残基，含有一个ＤＮＡＪ－Ｃ保守结构域，属于植物ＤＮＡＪ超家族。ｅｓＡＴＪ３基因编码的蛋白无信号肽，是一个亲水性蛋白，该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量ＰＣＲ分析表明，ｅｓＡＴＪ３基因在芸芥ｓＣ系开花前柱头中表达量较高，初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王卫平 崔娜 于志海 白丽萍 李天来
根据GeneBank中已登记的番茄果糖激酶基因的保守序列设计特异引物,以普通栽培型番茄辽园多丽的果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出果糖激酶基因cDNA序列的部分片段并克隆到pBS-T载体中。测序结果表明,LeFRK1-LeFRK3分别与番茄植物中已知该基因的核苷酸序列相似性高达99%以上,构建了一个番茄、马铃薯、烟草及拟南芥植物中FRK基因的系统进化树。采用半定量RT-PCR方法对番茄果实不同发育时期的表达进行检测,FRK1-FRK3在番茄果实发育的过程中均有表达,但在花后25～35 d时表达量较高。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李记园 王存芳 赵欢欢 王茅雁
为通过转基因植物等方法分析玉米ZmCBL2-2基因在耐逆性中的功能,运用RT-PCR(Reverse transcriptionPCR)方法克隆了该基因的编码区cDNA片段,并将其构建到植物表达载体p3301(pCAMBIA3301)上。同时,运用荧光实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术对玉米幼苗期该基因在高盐、低温和养分缺乏等6种非生物胁迫下的表达动态进行了分析,发现其对于缺N、低K、低温、外源ABA(Abscisic acid)和水分胁迫均有显著的应答反应,而对于盐胁迫无明显的响应。
关键词：
玉米 CBL 基因克隆 表达分析
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
黄雪玲 冯浩 康振生
【目的】克隆小麦蒜氨酸酶基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时定量表达检测。【方法】采用电子延伸结合RT-PCR方法,从小麦叶片分离出蒜氨酸酶基因,网络资源分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在不同条件下的表达情况。【结果】克隆到1个小麦蒜氨酸酶基因TaAly1,其开放阅读框全长1 023bp,编码340个氨基酸,与水稻和玉米蒜氨酸酶基因的同源性为70%,其基因组DNA序列含有3个内含子;TaAly1在小麦幼苗根部几乎不表达,在叶部表达量最高,其次是茎部;植物激素GA、MeJA、SA处理及条锈菌接种和干旱、低温处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。【结论】成功克隆了小麦TaAly1基因...
关键词：
小麦 蒜氨酸酶 RT-PCR 克隆
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张晨 王利凯 包亮 龙湍 陈春丽 须健
为研究水稻中PLT基因的表达及功能,利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到2个与拟南芥PLT基因高度同源的基因序列,命名为OsPLT7和OsPLT11。根据进一步预测的PLT启动子序列设计引物,以水稻品种中花11的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到PLT7、PLT11的启动子片段,克隆至含有报告基因的表达载体上并转化水稻。通过GUS染色观察T1代转基因阳性植株,发现OsPLT7和OsPLT11在水稻根部干细胞小生境和中柱部位表达,表达模式类似于其同源基因在拟南芥中的表达谱。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
占思远 董尧 李利 仲涛 王林杰 张红平
【目的】克隆获得南江黄羊ＩＧＦＢＰ－２（ＩｎｓｕｌＩｎ－ｌＩｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ＢＩｎｄＩｎＧ ＰｒｏｔｅＩｎ－２）基因的ｃｄｓ区全序列，对其进行生物信息学分析，并分析ＩＧＦＢＰ－２的ｍｒｎａ和蛋白组织表达特征，为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载ｎｃＢＩ的Ｇｅｎ Ｂａｎｋ数据库中公布的绵羊（ｏｖＩｓ ａｒＩｅｓ，ｎｍ＿００１００９４３６）和牛（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ，ｎｍ＿１７４５５５）的ＩＧＦＢＰ－２基因的ｍｒｎａ序列，经序列比对后采用保守区域序列并利用ＰｒＩｍｅｒ ＰｒｅｍＩｅｒ ６．０软件设计克隆引物，经Ｐｃｒ扩增后采用ｔ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭亚格 刘佳隆 齐志颖 何雷 贾艳艳 陈建 陈松彪 廖成水 丁轲 余祖华
【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2 221)H_(3 451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1 320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙海龙 宋娟 高志红 倪照君 章镇
【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并对其结构特征及表达模式进行分析,为研究果梅雌蕊败育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2(KNAT2的同源基因)序列(EF093491),根据桃的KNOPE2序列设计特异引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA;通过RT-PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长;使用DNAMAN软件进行序列拼接;利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;通过生物信息学方法分析结构特征;用DNAMAN软件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0软件进行系统进化树的构建;...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
甄军波 刘琳琳 杜海英 刘迪 蔡肖 张建宏 迟吉娜
【目的】甘油-3磷酸酰基转移酶(GPAT)是植物三酰甘油合成途径的3个关键酶之一,在油脂品质改良和生物质能源利用方面具有重要的应用价值。【方法】本研究通过同源克隆技术,从多年连续自交的海岛棉材料海资8号中获得了海岛棉甘油-3磷酸酰基转移酶基因,命名为GbGPAT2。【结果】GbGPAT2基因cDNA全长1294 bp,包含1个1113 bp的开放阅读框,编码1条370个氨基酸组成的多肽,预测分子量为42.4 kD,等电点为8.72。该基因编码的蛋白具有2个保守结构域,即典型的溶血磷脂酰基转移酶相似家族保守区(LPLAT-LPCAT1-like,Lysophospholipid Acyltransferases-Lysophospholipid Acyltransferases like)和酰基转移酶超家族保守结构域(NAT-SF, N-Acyltransferase superfamily)。GbGPAT2与小桐子、杨树、大豆和拟南芥的GPATs氨基酸同源性在91.2%～85.4%。跨膜区分析表明,GbGPAT2有2个跨膜结构域,亚细胞定位试验表明,GbGPAT2定位于细胞质膜上。qRT-PCR分析表明,GbGPAT2在胚发育的不同时期表达丰度不同,在开花后25 d的胚中表达量最大。【结论】推测GbGPAT2在海岛棉种子油脂合成中起重要作用。
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