【目的】DELLA蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族，是赤霉素信号转导途径中的重要调控因子，在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。克隆欧洲葡萄VvGAI1，并对其进行亚细胞定位、蛋白互作和表达分析，为进一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反应中的调控功能奠定基础。【方法】以酿酒葡萄品种‘霞多丽’叶片为试材，采用同源克隆的方法获得VvGAI1序列。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征，使用DNAMAN及MEGA7.0对VvGAI1蛋白序列及拟南芥序列进行多序列比对并构建系统进化树。通过亚细胞定位确定VvGAI1蛋白在细胞中的表达位置；利用酵母试验验证VvGAI1蛋白的转录激活活性；利用酵母双杂交和双分子荧光互补试验验证VvGAI1蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系；利用VvGAI1原核表达蛋白制备anti-VvGAI1兔源多克隆抗体；利用Western Blot技术检测VvGAI1蛋白在低温下的表达情况；通过相对电导率分析外源喷施茉莉酸和赤霉素对葡萄抗寒性的影响。【结果】从‘霞多丽’叶片中克隆得到VvGAI1，其ORF为1 773 bp，编码590个氨基酸，位于第1条染色体，含有1个外显子，无内含子。VvGAI1蛋白相对分子质量为64.87 kDa，理论等电点p I为5.31，属于酸性不稳定亲水蛋白。VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS结构域，属于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚类分析显示VvGAI1与拟南芥AtGAI和烟草Nt GAI1亲缘关系较近。亚细胞定位与转录自激活结果显示VvGAI1是一个定位于细胞核中且具有转录激活活性的转录因子。酵母双杂交和双分子荧光互补试验也证实VvGAI1与VvJAZ9具有互作关系。将VvGAI1克隆至原核表达载体构建pET28b-VvGAI1重组表达载体，转化至大肠杆菌BL21中经16℃、1.0 mmol·L~(-1)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达获得VvGAI1-His融合蛋白，再经抗原免疫，血清纯化后制备得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗体。制备的anti-VvGAI1抗体可以特异性检测‘霞多丽’葡萄中的VvGAI1蛋白。Western Blot结果表明，低温处理下葡萄原生质体中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表达趋势，VvGAI1蛋白响应低温诱导表达。与对照相比，50μmol·L~(-1)茉莉酸甲酯（Me JA）处理可以提高葡萄的抗寒性，50μmol·L~(-1)赤霉素（GA_3）处理使葡萄对寒冷变得敏感。【结论】葡萄VvGAI1是一个与VvJAZ9相互作用的转录因子，VvGAI1对低温胁迫有响应，外源茉莉酸能够正调控冷胁迫反应，而赤霉素负调控冷胁迫反应。

[目的]鉴定与山鸡椒精油合成关键酶香叶基二磷酸合酶(LcGPPS)的互作蛋白,为揭示山鸡椒精油主要成分单萜物质的合成机理奠定基础。[方法]通过本地Blast搜索山鸡椒果实转录组数据库,采用RT-PCR克隆山鸡椒GPPS基因(编码异质GPPS小亚基的LcGPPS.SSU1)和山鸡椒GGPPS基因(LcGGPPS1和LcGGPPS3);利用qRTPCR分析其组织特异性表达模式,通过蛋白互作预测和酵母双杂实验验证LcGPPS.SSU1分别与LcGGPPS1和LcGGPPS3的互作关系。[结果]克隆得到LcGPP

【目的】克隆苹果茉莉酸信号途径阻遏因子基因ＭｄＪＡＺ１，并对其表达及蛋白互作进行分析，为进一步研究ＭｄＪＡＺ１的功能奠定基础。【方法】以ＴＩＦＹ及ＪＡｓ功能域为探针，在苹果基因组中进行比对，获得多个同源基因，对其中的一个基因设计引物进行克隆；利用ｄＮＡＭＡＮ软件对该基因编码蛋白的分子量、等电点进行预测；利用ｓＭＡＲＴ在线分析软件对该蛋白的功能域进行分析；利用ＭＥＧＡ５．０对该蛋白与拟南芥ＪＡＺ家族蛋白构建系统发育树；利用荧光定量ＰＣＲ分析该基因在苹果不同组织器官、茉莉酸甲酯及创伤处理下的表达情况；利用ＰｌＡＮＴ ＣＡＲＥ在线软件分析该基因启动子区域的顺式作用元件；利用酵母双杂交系统检测ＭｄＪＡ．．．

【目的】研究新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆１号’液泡膜葡萄糖转运蛋白基因ＭｄＶＧＴ１生物学信息、表达水平及其在糖代谢中的功能，旨在为进一步完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供参考。【方法】以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆１号’为试材，克隆ＭｄＶＧＴ１，对其进行生物信息学分析；并采用荧光定量ＰＣＲ分析该基因在不同组织及不同发育时期的表达，分析‘嘎啦’组培苗中该基因在葡萄糖诱导下的表达，通过酵母双杂交验证其互作关系，并通过原核诱导获得重组蛋白。【结果】在‘红脆１号’中克隆获得ＭｄＶＧＴ１全长，测序发现其包含１ ５０６ ｂＰ完整的开放阅读框，编码５０１个氨基酸，预测其编码蛋白质分子量为５３．１６ ．．．

【目的】克隆苹果(Malus domestica)中的TT2同源基因MdMYB9和MdMYB11,分析它们的序列特征,并对这两个基因在不同组织器官及光诱导条件下的表达特性及蛋白互作进行分析,为进一步解析这两个基因的功能奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法分离得到MdMYB9和MdMYB11;利用DNAMAN软件对这两个蛋白的分子量、等电点等进行预测及对氨基酸序列进行分析,同时利用MEGA4.0软件构建这两个蛋白与拟南芥R2R3家族MYB蛋白的系统进化树;利用定量PCR检测这两个基因在不同组织器官、不同发育时期苹果果皮及种子和光照处理条件下的表达特性;利用酵母双杂交检测这两个MYB蛋白与花青苷合...

翻译起始因子是一类翻译起始所必需的特异蛋白因子,前期研究表明柽柳翻译起始因子(The IF1A)基因能对外界盐和干旱等非生物胁迫做出响应,且过表达The IF1A基因能提高酵母和烟草的抗旱耐盐能力。为进一步研究The IF1A基因的抗逆机制,本研究通过酵母双杂交对柽柳翻译起始因子(The IF1A)基因的互作蛋白进行了筛选,共获得5个互作蛋白,分别为RNA聚合酶βII亚基(RNA polymerase beta II subunit)、ATP合成酶CF1α亚基蛋白(ATP synthase CF1 alpha subunit protein)、细胞色素b6/f复合物亚基IV(cytochrom...

【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶ＶＶ ＣＩＰＫ１０，分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式，为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能，探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得ＶＶ ＣＩＰＫ１０序列，设计特异引物进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析；构建原核表达载体，转化表达菌株后用ＩＰＴＧ进行诱导表达，收集菌体后裂解细胞，制备蛋白上样液，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳对表达产物进行分析，同时对融合蛋白进行可溶性分析；ＩＰＴＧ大量诱导表达融合蛋白，收集菌体后进行超声破碎细胞，用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化ＭＢＰ－ＶＶ ＣＩＰＫ１０融合蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧ．．．

为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(GOD)在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(GOD)基因定向克隆于原核表达载体pET-11a上,构建了融合表达的重组质粒pET/GO,转化E.coliBL21(DE3)plysS,用IPTG诱导,超声波粉碎细菌细胞,SDS-PAGE电泳检测,GOD基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5 kDa。用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(ELISA)测定其效价为106,West-ern-blot分析证明表达的融合蛋白与兔抗GOD血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(GOD)抗体的制备...

【目的】由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌引起的溃疡病是葡萄生产上的重要病害之一,在国内多个葡萄产区发生,严重威胁葡萄的产量及品质。本研究对葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)中一个假定外泌蛋白LtGH61A进行功能分析,为进一步解析葡萄溃疡病菌的致病机理及病害防控提供理论依据。【方法】通过SignalP 4.0预测LtGH61A蛋白的信号肽;氨基酸序列同源比对结合基因功能注释,预测LtGH61A蛋白的功能;通过酵母互补试验分析LtGH61A蛋白的外泌特性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析LtGH61A在病原菌营养菌丝及侵染寄主不同阶段的表达量;借助RNA干涉(RNAi)对LtGH61A进行表达抑制;通过葡萄枝干离体接种试验,分析LtGH61A蛋白对葡萄溃疡病菌致病力的影响。通过比较菌落直径,分析LtGH61A蛋白对葡萄溃疡病菌菌丝生长速率的影响。【结果】信号肽预测表明LtGH61A蛋白N端具有一个长度为18个氨基酸的信号肽;基因功能注释推定LtGH61A的编码产物属于糖苷水解酶61(GH61)家族,能酶解纤维素类物质;互补蔗糖酶外泌缺陷型酵母YTK12结果表明,LtGH61A蛋白的信号肽具有外泌活性,能够引导酵母YTK12蔗糖酶的外泌;与营养菌丝阶段相比,LtGH61A的表达量在病原菌侵染阶段显著升高,并且在接种后48 h高达营养菌丝阶段的19倍;通过RNAi试验及qRT-PCR验证,获得了2个LtGH61A表达量明显降低的阳性转化子,分别命名为RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2;葡萄枝干离体接种试验结果显示,与野生型CSS-01s相比,RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2转化子在葡萄枝干形成的病斑长度显著变短,约为野生型CSS-01s的55%,表明LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的致病力;菌落直径比较显示,与野生型CSS-01s相比,RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2转化子的菌落直径变小,约为野生型85%,表明LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的菌丝生长速率。【结论】LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的致病力及生长速率;LtGH61A蛋白能够分泌至胞外;LtGH61A在病原菌侵染阶段的表达量显著升高,推测其通过发挥自身酶活功能,破坏寄主植物组织,从而促进病原菌的侵染。

[目的]本文旨在揭示General control non-repressible 5 (GCN5)在葡萄生长发育过程中的调控机制，并筛选出与VvGCN5互作的蛋白，以期为进一步构建VvGCN5在葡萄生长发育中的调控网络提供理论基础。[方法]利用生物信息学技术对VvGCN5的蛋白二级结构、基因结构、功能域、启动子的顺式作用元件以及抗逆的表达量和时空表达进行分析。并在烟草中进行亚细胞定位，研究VvGCN5表达位置。通过酵母双杂技术筛选与VvGCN5互作的蛋白，并通过BIFC进行验证。[结果] VvGCN5的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠以及无规则卷曲构成，含有10段内含子序列和11段CDS序列，拥有Acetyltransf＿1和Bromodomain结构域，以及ARE、GT1-motif、TGACG-motif、CAT-box、CGTCA-motif等顺式作用元件。通过查询GEO数据库发现VvGCN5可能受到光照和霜霉病的影响。VvGCN5主要表达于葡萄的成熟茎、萌芽初期、心皮、种子中。亚细胞定位发现VvGCN5位于细胞核和细胞膜上。此外，以pGBKT7-VvGCN5作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术发现了8个阳性蛋白与VvGCN5互作。[结论]本研究鉴定并分析了VvGCN5的基本信息，并得到了8个与VvGCN5互作的蛋白。

[目的]本文旨在揭示组蛋白乙酰转移酶GCN5(general control non-repressible 5)在葡萄生长发育过程中的调控机制，并筛选出与VvGCN5互作的蛋白，以期为进一步构建VvGCN5在葡萄生长发育中的调控网络提供理论基础。[方法]利用生物信息学技术对VvGCN5的蛋白二级结构、基因结构、功能域、启动子的顺式作用元件以及抗逆的表达量和时空表达进行分析，并在烟草中进行亚细胞定位，研究VvGCN5表达位置。通过酵母双杂交技术筛选与VvGCN5互作的蛋白，并通过双分子荧光互补(BIFC)技术进行验证。[结果]VvGCN5的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠以及无规则卷曲构成，含有10段内含子序列和11段CDS序列，具有Acetyltransf＿1和Bromodomain结构域，以及ARE、GT1-motif、TGACG-motif、CAT-box、CGTCA-motif等顺式作用元件。通过查询GEO数据库发现VvGCN5可能受到光照和灰霉病的影响。VvGCN5主要表达于葡萄的成熟茎、萌芽初期、心皮、种子中。亚细胞定位发现VvGCN5位于细胞核和细胞膜上。此外，以pGBKT7-VvGCN5作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术发现8个阳性蛋白与VvGCN5互作。[结论]本研究鉴定并分析了VvGCN5的基本信息，并得到了8个与VvGCN5互作的蛋白。

设置持续投喂组(C,持续投喂8周)、饥饿再投喂组(R,饥饿4周+再投喂4周)和持续饥饿组(S,饥饿8周)3个处理组,研究3种不同饥饿处理对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)血清生化指标、糖原和糖代谢相关酶和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的影响,同时在此实验基础上研究草鱼在急性高糖负荷胁迫下的糖耐受能力、糖代谢相关酶和GLUT1的变化规律,旨在阐明草鱼在饥饿及再投喂处理条件下的糖代谢特征。选取初重为(125.35±0.54)g的草鱼,饲养8周后以30 mg/100 g体重的剂量腹腔注射

【目的】适宜的温度是葡萄生长发育的必要条件,南方地区葡萄在成熟期常常经历连续高温环境,叶片容易失水干枯,果实会发生明显的日灼,严重地影响了其经济效益。选择不同树龄葡萄树进行高温胁迫的相关研究,以解释高温对葡萄的伤害,为生产中高温逆境的抵御措施提供理论依据。【方法】选择南方地区常见的鲜食葡萄品种‘巨峰’‘巨玫瑰’‘醉金香’‘夏黑’‘申玉’‘申丰’‘申华’和‘沪培1号’为试验材料,其中葡萄幼苗选择长势基本一致的1年生扦插苗移至人工气候培养箱,在可控条件下培养7 d后于每天10:00—16:00(模拟夏季高温发

为探究2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C, PP2C）在木薯响应非生物胁迫过程中的作用，利用木薯Arg7叶片cDNA扩增MePP2CAa基因，分析该基因序列、启动子活性、不同逆境和激素处理下的表达模式以及与ABA受体PYLs之间的互作关系。序列分析结果显示，MePP2CAa基因全长1 311 bp，编码436个氨基酸，具有PP2C家族的结构域特征，与橡胶树和麻风树的PP2C序列同源性最高，分别为78.95%和74.09%，在C端保守；qRT-PCR分析结果显示，MePP2CAa基因在木薯储藏根中的表达显著高于茎、叶中的表达量；不同逆境和激素处理结果显示，甘露醇、NaCl、ABA、MeJA、低温和SA处理可以显著诱导MePP2CAa基因的表达；MePP2CAa基因启动子序列分析显示，启动子包含ABA应答元件（abscisic acid responsive element,ABRE）、MeJA响应元件、干旱诱导元件等；酵母双杂交结果显示MePP2CAa能够与MePYL1互作。以上结果表明，MePP2CAa基因可能响应木薯的非生物胁迫。

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP(basic-leucine zipper)转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过...