为探索ＳＷＥＥＴ基因家族在葡萄果实发育中的表达与功能，以本实验室完成的酿酒葡萄品种赤霞珠Ⅰ期和Ⅲ期果实的转录组数据为基础，筛选出在Ⅰ期和Ⅲ期表达量存在显著差异的９个ＳＷＥＥＴ基因家族成员，利用生物信息学工具，对这９个基因的基因结构、蛋白的基本理化性质、二级结构、亚细胞定位、保守基序和序列同源性等进行预测分析，并利用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）技术对分析结果进行验证。基因组定位结果发现这９个ＳＷＥＥＴ基因分布在７条染色体上，蛋白序列可分成４个亚族。不同成员间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异；二级结构预测结果显示，这９个ＳＷＥＥＴ基因的氨基酸序列以α－螺旋和无规则卷曲为主要组成部分．．．

利用生物信息学工具,将拟南芥DELLA相关基因序列作为靶序列,在葡萄基因组序列预测出2条DELLA相关基因(序列号为GSVIVT00030538001和GSVIVT00032990001),并进行克隆测序验证和生物信息学分析。经比对发现,它们分别与拟南芥RGA和RGL1相似度较高,为63.59%和51.28%,故分别将其命名为VvRGA和VvRGL1,并进一步对其氨基酸组成成分、理化性质及二级和三级结构进行初步分析。结果表明:VvRGA和VvRGL1均具有保守的GRAS结构域和DELLA结构域;它们与拟南芥相关基因在氨基酸数目和氨基酸序列间的疏水性很相似,但存在一定的差异;两者的二级结构都主要...

【目的】ＯＶＡＴＥ是一类调控植物生长发育的转录抑制因子，对葡萄ＯＶＡＴＥ基因家族（ＶＶ ＯＦＰｓ）进行生物信息学和组织特异性表达分析，为该类基因的功能研究奠定基础。【方法】根据ＯＶＡＴＥ保守域蛋白序列（ＰＦ０４８４４）对葡萄ＯＶＡＴＥ基因家族进行鉴定，利用生物信息学方法对葡萄ＯＶＡＴＥ基因家族染色体定位、基因结构、保守结构域、亚细胞定位等方面进行预测和分析，并分析葡萄和拟南芥ＯＶＡＴＥ基因家族的进化关系。采用实时荧光定量ＰＣＲ技术检测ＶＶ ＯＦＰｓ组织表达特性。【结果】葡萄ＯＶＡＴＥ基因家族包含１７个成员，不均匀地分布在１１条染色体上，均没有内含子结构，编码１１５—４４４个氨基酸，等电点４．５．．．

【目的】明确DELLA蛋白基因在葡萄基因组数据库中的数量、结构和组织表达差异,探究DELLA蛋白在葡萄赤霉素(GA)信号传导及葡萄无核果实发育机理中的作用机制。【方法】基于拟南芥、水稻等植物中的DELLA蛋白基因,利用HMMER程序和NCBI的CDD程序鉴定葡萄基因组中的DELLA蛋白基因;以‘白罗莎里奥’葡萄品种为试材,采用PCR技术克隆3个DELLA蛋白基因的c DNA全长序列;通过启动子作用元件分析预测其潜在功能;利用生物信息学软件对其染色体定位、基因结构、系统进化、理化特性、亚细胞定位及蛋白互作等进行分析;利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术分析DELLA蛋白的亚细胞定位情况;采用q RT-PCR方法检测葡萄DELLA蛋白基因应答GA在果皮、果肉、种子(或种子区)的时空表达特征。【结果】鉴定得到3个葡萄DELLA蛋白基因,克隆并验证其精确序列,分别命名为Vv GAI1(VIT_201s0011g05260)、Vv RGA(VIT_214s0006g00640)及Vv SLR1(VIT_211s0016g04630),其染色体定位、开放阅读框(ORF)大小、编码氨基酸数量分别为:Chr1、1 773 bp、590个;Chr14、1 710 bp、569个;Chr11、1 599 bp、532个。基因结构分析表明其DNA序列均无内含子,只有1个外显子,基因结构高度保守。进化分析显示Vv GAI1与Vv RGA亲缘关系较近,被聚类为一组,而Vv SLR1为另一组。3个基因的启动子均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的作用元件,表明它们可能参与响应GA信号传导和胚乳发育过程。亚细胞定位结果显示3个DELLA蛋白均定位于细胞核。q RT-PCR结果显示除果皮中Vv SLR1在近成熟期具有表达高峰外,其余均在幼果期高表达,且外源GA处理均不同程度降低了3个DELLA蛋白基因在葡萄果皮、果肉和种子区的表达,尤以种子区下调水平最为显著。蛋白互作分析表明3个DELLA蛋白均为葡萄GA信号传导的核心作用元件,均可能与GIDI1和SLY1互作参与葡萄GA信号传导。【结论】葡萄基因组中含有3个DELLA蛋白基因家族成员;不同物种间DELLA蛋白结构高度保守;GA可能通过负调控这3个成员参与葡萄果皮、果肉和种子区的发育,且3个成员均可能通过应答GA信号调控葡萄无核果实的发育。

SBP基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,含79个氨基酸残基保守结构域,主要参与植物生长发育、生理生化过程。为进一步探讨小麦SBP基因家族的基因功能,通过比对小麦最新基因组数据,结合公布的Chinese Spring的基因组数据,采用生物信息学方法对其基因结构、染色体分布、蛋白保守结构域、系统进化树及表达谱进行分析。结果获得了50个SBP基因,命名为TaSBPs,根据染色体编号排列为TaSBP1～TaSBP50。结果表明,50个小麦TaSBP基因分布于除4B、4D染色体外的其余19条染色体上,编码192～1 104个氨基酸,基因外显子数量2～11个变化不等;串联重复和片段复制是小麦SBP家族基因扩张的主要模式; 7种作物SBP基因的系统进化树可分为4个类别,同一类之间的结构较为相似;小麦50个TaSBP基因家族含有10个motif,推测小麦TaSBP基因家族应都含有motif1、motif2、motif4。50个TaSBP基因都在13个组织器官中检测到转录本,不同组织器官中TaSBP基因的表达存在明显的差异。

利用Blastp比对程序对甜荞基因组数据库进行搜寻,共鉴定到23个甜荞HSF基因。基因结构分析显示,所有HSF基因都含有内含子,且大部分基因只含有1个内含子。蛋白序列多序列比对分析表明,23个HSF蛋白均含有氨基酸序列高度保守的DNA结合域(DNA–binding domain,DBD)和不保守的寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)。蛋白保守基序分析表明,23个HSF蛋白共包含10个保守基序,基序长度为11~62个氨基酸,其中基序1、2和3代表DBD区。亚细胞定位分析表明,除Fe HSF13、Fe HSF14和Fe HSF18同时定位于细胞核和细胞质上,其余20个Fe HSF蛋白均定位于细胞核上。磷酸化位点分析表明,所有HSF蛋白均含有潜在的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点,部分HSF蛋白还含有酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。系统发育分析表明,23个HSF基因可以分为A、B和C 3类,进一步细分为A1、A3、A4、A5、A6、A7、A9、B3、B4和C共10个亚类。

[目的]本文旨在研究葡萄(Vitis vinifera)无内含子基因的结构特征、功能以及表达特点。[方法]对葡萄19条染色体上4 906个(占整个基因组的13.8%)无内含子基因情况进行分析,并研究了无内含子基因的亚细胞结构、GO功能类型以及基因在不同组织的表达情况。[结果]葡萄无内含子基因数与每条染色体长度和染色体的基因总数存在正相关关系,每条染色体上无内含子基因占染色体上基因总数的1.2%~1.5%,同时无内含子基因在同一条染色体上的分布是不均匀的,更偏向富集于染色体的两端。葡萄无内含子基因的平均长度为997 bp,比总基因的平均长度短,是总基因长度的1/5。葡萄无内含子基因的亚细胞定位表明,基因产物分布在叶绿体上的数最多,线粒体上几乎没有。基因功能预测结果表明,葡萄无内含子基因主要为生长因子、转录调控、电压门控离子通道以及结构蛋白4种,其中更多参与生长调节。葡萄无内含子基因在不同组织中的表达水平低于有内含子的基因。[结论]葡萄无内含子基因与有内含子基因相比长度较短,表达水平较低。

【目的】通过克隆细胞分裂素脱氢酶/氧化酶基因VlCKX4及其启动子，进行表达特性分析和启动子活性分析并进行转录因子预测，为深入解析VlCKX4介导细胞分裂素信号途径调控葡萄坐果的分子机制提供依据。【方法】使用生物信息学方法分析‘巨峰’葡萄(Vitis vinifera×Vitis labrusca)细胞分裂素氧化酶/脱氢酶4(VlCKX4)的序列特征；利用PCR技术克隆该基因以及它的启动子，使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)分析VlCKX4的表达特性，GUS活性试验用于分析其启动子活性；利用PlantTFDB、CisBP等转录调控数据库对VlCKX4的转录调控关系进行预测分析，输出结果使用Gephi软件进行可视化。【结果】VlCKX4全长1 582 bp,其中包含1 566 bp的开放阅读框，编码522个氨基酸，具有家族特征的FAD结构域和细胞分裂素结合（ck-binding）结构域。qRT-PCR结果表明VlCKX4在花序中高表达，其次是叶片，在卷须中表达量最低；细胞分裂素CPPU处理后VlCKX4表达量先下降后上升，细胞分裂素抑制剂洛伐他汀(Lov)处理后VlCKX4表达量先上升后下降。顺式元件分析表明VlCKX4启动子中含有吲哚乙酸、茉莉酸甲酯等响应元件；GUS化学组织染色试验表明，VlCKX4响应这些激素的处理。VlCKX4转录调控预测分析结果显示，MYB、DOF和WRKY类转录因子对其进行转录调控，结合转录组数据和共表达关系确定WRKY20、DOF1.5和MYB59为关键候选转录因子。【结论】葡萄VlCKX4受到细胞分裂素CPPU的诱导，VlCKX4启动子受到WRKY20、DOF1.5和MYB59转录因子的调控，参与促进葡萄坐果过程。

【目的】通过生物信息学分析明确SAP(Stress Associated Protein)家族在葡萄基因组中的数量、结构,利用qRT-PCR技术分析SAP家族的生物节律和在激素、非生物胁迫处理下的表达模式,为进一步探究SAP家族在葡萄中的作用奠定基础。【方法】在前期从山葡萄‘双优’(Vitis amurensis cv.Shuangyou)和欧洲葡萄‘红地球’(Vitis vinifera cv.Red Globe)0℃寒胁迫下转录组数据库中筛选出表达量明显上调的基因SAP15基础上,利用NCBI和葡萄基因组数据库中的BLAST功能,根据SAP家族的保守结构域,鉴定葡萄基因组中的SAP。利用生物信息学软件DNAMAN5.0、MEME、GSDS2.0、ExPASy和MEGA6等对VvSAPs序列、基因结构、蛋白质结构、理化性质、染色体定位和进化树等进行分析。采用qRT-PCR方法检测VvSAP家族的生物节律和在激素、逆境处理下的表达特征。【结果】从葡萄(Vitis vinifera)全基因组中鉴定得到15个SAP家族成员,均含有AN1保守结构域,大多含有A20保守结构域。按照其保守结构域和在染色体上的位置,依次命名为VvSAP1—VvSAP15,可分为ClassⅠ、ClassⅡ和ClassⅢ三类。理化性质分析表明,VvSAP家族编码氨基酸数目介于109—293,理论等电点分布在7.99—9.68。染色体定位分析发现,该基因家族的15个基因分布于葡萄的9条染色体上,其中第8条染色体上分布最多,有3个VvSAP。亚细胞定位分析表明,VvSAP家族主要在细胞核、叶绿体和细胞骨架中进行表达。VvSAP家族的二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。基因结构分析表明,VvSAP1—VvSAP12的DNA序列中均无内含子,VvSAP13—VvSAP15的DNA序列中有1个内含子,基因结构高度保守。qRT-PCR分析结果表明,在VvSAP家族成员中,VvSAP1和VvSAP9在无处理和各处理下(激素和非生物胁迫)均表达极低或不表达,初步鉴定为假基因。除VvSAP10在400 mmol·L~(-1) NaCl处理下呈下调表达,其余基因均在50μmol·L~(-1) ABA、100μmol·L~(-1 )SA和400 mmol·L~(-1 )NaCl处理下呈上调表达,其中,VvSAP10—VvSAP14显著响应50μmol·L~(-1) ABA胁迫,处理24 h后相对表达量分别上调为0 h的37.19、36.63、21.69、58.34和267.35倍;VvSAP8和VvSAP11在NaCl处理4 h后相对表达量最高,分别为0 h的13.16和12.42倍;在4℃低温胁迫下,相对表达量上调最高的是VvSAP15,处理后8 h相对表达量为0 h的35.90倍。【结论】从葡萄基因组中共鉴定出15个SAP家族成员,初步鉴定得出VvSAP1和VvSAP9为假基因,15个基因分别分布于9条染色体上,并且结构进化高度保守。所有成员均相响应逆境,且均有昼夜节律变化,但该基因家族成员在不同逆境胁迫下的响应程度和在不同时间点的表达模式存在一定的差异。

【目的】通过生物信息学分析明确LBD转录因子在葡萄基因组中的数量、结构和非生物胁迫差异表达,为探究LBD转录因子在葡萄非生物胁迫中的作用奠定理论基础。【方法】根据已经报道的拟南芥LBD基因,利用葡萄基因组数据库中的BLAST软件鉴定葡萄基因组中的LBD基因。采用DNAMAN5.0、Clustalx、MapInspect、MEME、GSDS2.0、ExPASy和MEGA5.0等软件进行生物信息学分析。利用PLEXdb中葡萄Affymetrix GeneChip 16K基因芯片数据绘制芯片表达谱。采用qRT-PCR方法检测VvLBD基因家族在逆境胁迫中的表达情况。【结果】从葡萄(Vitis vinifera L.)全基因组中鉴定得到30个LBD基因家族成员,可分为ClassⅠ和ClassⅡ两类,ClassⅠ分为5个亚族,分别是Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe,ClassⅡ分为2个亚族,分别是Ⅱa和Ⅱb。理化性质分析表明,VvLBD基因家族编码氨基酸数目介于127—386,理论等电点分布在4.77—9.28。定位分析发现,该基因家族的30个基因分布于葡萄19条染色体中的11条染色体上,其中第13染色体上分布最多,有7个基因。多序列比对和motif分析结果表明,VvLBD基因家族具有特定的3个保守结构域,分别是类锌指结构、亮氨酸拉链结构和甘氨酸-丙氨酸-丝氨酸(GAS)结构。亚细胞定位分析表明,VvLBD基因家族主要在叶绿体、线粒体和细胞核中进行表达。VvLBD基因家族的二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主。VvLBD基因芯片表达谱分析发现,大部分基因在盐胁迫和PEG胁迫下表达量上升,并且胁迫时间的长短对该基因家族成员的表达也存在差异。qRT-PCR分析结果表明,VvLBD基因家族成员中VvLBD8、VvLBD11、VvLBD12、VvLBD15、VvLBD16、VvLBD17在400 mmol·L-1 NaCl处理条件下呈上调表达,表达量分别是对照的3、1、8、4、5和13倍,VvLBD12和VvLBD19在10%PEG处理条件下呈上调表达,表达量分别是对照的4和26倍。【结论】从葡萄基因组中一共鉴定出30个LBD基因家族成员,分布于11条染色体上,并且结构进化高度保守;所有成员都与逆境相关,但是该基因家族成员在不同逆境胁迫下的响应程度存在一定的差异。

为了对葡萄HXK基因家族进行鉴定和表达分析,利用拟南芥和玉米的HXK(Hexokinase)基因注册序列,从葡萄全基因组中鉴定得到HXK基因4个,并命名为VvHXK1、VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4,对其进行生物信息学分析。蛋白质理化性质分析结果表明,每个基因编码的氨基酸个数分布在412-524 aa,VvHXK4是碱性蛋白,其余3个均为酸性蛋白;亚细胞定位分析表明,4个VvHXK基因都在细胞质中表达,且VvHXK4主要定位于叶绿体,而VvHXK2也存在于线粒体和细胞核中;蛋白质的二级结构预测表明,4个VvHXK基因编码的蛋白主要以α-螺旋为主;外显子结构分析表明,除VvHXK1含10个外显子外,其余3个都有9个外显子,说明VvHXK基因比较保守;启动子顺式作用元件分析表明,4个VvHXK基因均含有ABA响应元件和MYB及WRKY转录因子的结合区域,而VvHXK4中没有发现低温响应元件;系统进化树分析表明,VvHXK1与拟南芥AtHXK1的同源关系最近,推测其不仅具有调节生长发育,影响根系的生长等功能,而且具有加速衰老的作用。VvHXK2与马铃薯StHXK1的同源关系最近,推测其具有使叶绿体中的葡萄糖磷酸化活性升高的功能。VvHXK3与马铃薯StHXKRP1的同源关系最近,可能具有诱导离体叶片中糖表达的作用。VvHXK4与菠菜SoHXK1的同源关系最近。荧光定量分析表明,VvHXK2、VvHXK3和VvHXK4均在20 g/L的葡萄糖处理下相对表达量最高,即其对葡萄糖磷酸化最显著,在果糖和蔗糖的处理下表达量较低。

赤霉素(GA)促进葡萄果实的膨大,目前对外源赤霉素促进葡萄果实膨大的信号转导途径还不完全清楚。有研究发现GA3处理后葡萄果实中一个SCARECROW(SCR)蛋白的表达出现上调,为了进一步揭示GA的作用途径,本研究通过分析在其他植物中已经确认的SCR基因序列,对葡萄全基因组进行BLAST比对,获得了可能编码葡萄SCR的11个基因片段序列SCRs。分别设计特异性引物,以无核白鸡心葡萄(Vitis vinifera L.cv.Centennial seedless)不同组织器官,以及盛花后12d以30mg/L GA3处理无核白鸡心葡萄的花序,并于花后13、15、19、45、61d采收的果实为材料,...

【目的】鉴定葡萄miR159家族成员及其靶基因,明确葡萄miR159家族成员及其靶基因应答外源赤霉素(GA)在无核葡萄果实不同组织发育过程中的作用。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄(Rosario Bianco)为试材,利用miR-RACE和PCR技术克隆鉴定VvmiR159a/b/c的成熟体及前体序列;通过PsRNATarget软件预测VvmiR159s的靶基因,利用生物信息学软件对其进行系统进化及保守结构域分析;通过启动子作用元件分析预测VvmiR159s及其靶基因的潜在功能;采用RLM-RACE和PPM-RACE验证VvmiR159s对靶基因的裂解作用;利用qRT-PCR鉴定其应答外源GA在葡萄果实不同组织发育过程中的时空表达模式。【结果】从‘白罗莎里奥’葡萄果实中克隆获得VvmiR159a/b/c的成熟体序列、前体序列并折叠发夹结构。鉴定到VvmiR159s的四条靶基因(VvGAMYB、VvMYB48、VvAIX15、VvGRAS-l),其中VvmiR159s与VvGAMYB匹配程度最高,与VvAIX15匹配程度最低。靶基因系统进化及保守结构域分析显示,4条靶基因与其他物种同源基因具有较高同源性。VvmiR159s前体基因及其靶基因启动子的激素响应元件均以赤霉素和水杨酸响应元件为主,表明其可能主要通过应答这两种激素参与调控葡萄的生长发育过程。VvmiR159s在不同组织中的表达具有时空特异性,其中VvmiR159c在果皮和果肉中的表达趋势不同,在果皮中VvmiR159a/b/c与VvAIX15的表达水平呈负相关;而在果肉中,VvmiR159a/b与VvGAMYB和VvAIX15的表达模式相反。此外,在葡萄果皮、果肉中GA处理可显著下调VvmiR159a/c的表达,但却在幼果果肉中上调VvmiR159b的表达。表明葡萄miR159家族成员在果实不同组织中通过不同模式应答GA信号参与果实发育的调控。【结论】葡萄miR159家族含有VvmiR159a/b/c 3个成员;3个成员均可切割VvGAMYB、VvMYB48、VvAIX15及VvGRAS-l 4个靶基因;VvmiR159a/b/c及其4个靶基因可能以不同的GA应答模式参与调控葡萄果皮与果肉的发育。