本研究通过分析在其他植物中已经确认的GA受体基因序列,对葡萄全基因组进行BLAST比对,获得了可能编码葡萄GA受体GID1的7个基因片段序列。经过聚类分析,根据其序列特征,分别设计特异性引物,以无核白鸡心葡萄(Vitis viniferaL.cv.Centennial seedless)不同组织器官为试材提取RNA,反转成cDNA-1链后,进行半定量RT-PCR,结果显示这些基因在成叶、幼叶、花序、新梢顶尖和休眠芽中存在差异表达。以30 mg/L的GA3在盛花后12 d处理无核白鸡心果穗,并于处理后1、3和7 d(果实第1次快速生长期),33 d(缓慢生长期),49 d(果实第2次快速生长期)...

为了探明‘峰后’葡萄赤霉素(GA3)处理后促使果粒变长的原因和VvSEP3基因在果实早期发育中的作用,在开花前利用0.1mg/g GA3处理花序并通过原位杂交分析了VvSEP3基因的表达。结果显示:GA3处理提高了峰后葡萄的坐果,增加了果形指数,从开花后14d开始到开花后56d,GA3处理后的果实纵径始终大于同时期的对照果实,解剖学结构研究表明,中果皮的细胞膨大从开花后7d开始明显大于同时期发育的对照果粒。VvSEP3基因在开花期的柱头、花柱、横膈膜以及胚珠的珠心组织中有表达,开花后主要在子房壁中表达,当幼胚发育时在维管束组织和胚乳组织中有所表达。本研究显示GA3处理后明显增加峰后葡萄的果形指...

为探讨外源GA介导的无核葡萄果实膨大的机理,本试验根据葡萄基因组序列设计特异性引物,以葡萄果实cDNA一链为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)克隆了2个假定的葡萄GID基因。测序比对结果表明其中一个属于GID1ac家族,根据序列相似性,命名为VvGID1-3,另一个属于GID2 F-box基因家族,命名为VvGID2。在烟草中分别超表达这2个基因,结果表明:VvGID1-3和VvGID2转基因植株叶圆片在MS培养基上生长7d后面积都约为对照的140%;VvGID1-3和VvGID2转基因烟草种子的萌发率降低,萌发过程对0.5和1μmol/L的GA3处理表现超敏特征;内源激素水平测定结果显示Vv...

【目的】鉴定葡萄miR159家族成员及其靶基因,明确葡萄miR159家族成员及其靶基因应答外源赤霉素(GA)在无核葡萄果实不同组织发育过程中的作用。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄(Rosario Bianco)为试材,利用miR-RACE和PCR技术克隆鉴定VvmiR159a/b/c的成熟体及前体序列;通过PsRNATarget软件预测VvmiR159s的靶基因,利用生物信息学软件对其进行系统进化及保守结构域分析;通过启动子作用元件分析预测VvmiR159s及其靶基因的潜在功能;采用RLM-RACE和PPM-RACE验证VvmiR159s对靶基因的裂解作用;利用qRT-PCR鉴定其应答外源GA在葡萄果实不同组织发育过程中的时空表达模式。【结果】从‘白罗莎里奥’葡萄果实中克隆获得VvmiR159a/b/c的成熟体序列、前体序列并折叠发夹结构。鉴定到VvmiR159s的四条靶基因(VvGAMYB、VvMYB48、VvAIX15、VvGRAS-l),其中VvmiR159s与VvGAMYB匹配程度最高,与VvAIX15匹配程度最低。靶基因系统进化及保守结构域分析显示,4条靶基因与其他物种同源基因具有较高同源性。VvmiR159s前体基因及其靶基因启动子的激素响应元件均以赤霉素和水杨酸响应元件为主,表明其可能主要通过应答这两种激素参与调控葡萄的生长发育过程。VvmiR159s在不同组织中的表达具有时空特异性,其中VvmiR159c在果皮和果肉中的表达趋势不同,在果皮中VvmiR159a/b/c与VvAIX15的表达水平呈负相关;而在果肉中,VvmiR159a/b与VvGAMYB和VvAIX15的表达模式相反。此外,在葡萄果皮、果肉中GA处理可显著下调VvmiR159a/c的表达,但却在幼果果肉中上调VvmiR159b的表达。表明葡萄miR159家族成员在果实不同组织中通过不同模式应答GA信号参与果实发育的调控。【结论】葡萄miR159家族含有VvmiR159a/b/c 3个成员;3个成员均可切割VvGAMYB、VvMYB48、VvAIX15及VvGRAS-l 4个靶基因;VvmiR159a/b/c及其4个靶基因可能以不同的GA应答模式参与调控葡萄果皮与果肉的发育。

[目的] 本文旨在探讨5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）处理对葡萄果实可溶性糖和花色苷含量以及相关基因表达的影响，为5-ALA在鲜食葡萄生产中应用提供理论依据。[方法] 以16个鲜食葡萄品种为试材，在膨大期果实表面喷施100 mg·100 g~(-1 )5-ALA溶液，以清水处理为对照，测定果实发育过程中外观色泽指数、可溶性固形物、可溶性糖、花色苷等生理指标及相关基因表达水平的变化。[结果] 5-ALA处理能诱导‘巨玫瑰’等大多数葡萄品种提前转色，果实色泽指数增加，果肉中可溶性固形物和可溶性糖含量显著增加，果皮中总花色苷含量以及锦葵色素等花色苷组分含量显著增加。基因表达分析结果显示，5-ALA处理能促进大多数葡萄品种果肉中酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）基因表达水平增加，抑制蔗糖转运蛋白（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因表达水平，进而提高葡萄果肉可溶性糖含量；并且5-ALA处理能诱导不同葡萄品种果皮中查尔酮合酶（CHS）、UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡萄糖转化酶（UFGT）、无色花青素双加氧酶（LDOX）等基因表达水平增加，进而促进葡萄果皮花色苷积累。[结论] 综上所述，对不同葡萄品种果实外源喷施100 mg·100g~(-1) 5-ALA，不仅能不同程度地促进果肉中糖分积累，提高果实内在品质；还能不同程度地促进果皮中花色苷积累，改善果实外在品质。为5-ALA在葡萄优质化生产中的应用奠定了理论基础。

为探索ＳＷＥＥＴ基因家族在葡萄果实发育中的表达与功能，以本实验室完成的酿酒葡萄品种赤霞珠Ⅰ期和Ⅲ期果实的转录组数据为基础，筛选出在Ⅰ期和Ⅲ期表达量存在显著差异的９个ＳＷＥＥＴ基因家族成员，利用生物信息学工具，对这９个基因的基因结构、蛋白的基本理化性质、二级结构、亚细胞定位、保守基序和序列同源性等进行预测分析，并利用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）技术对分析结果进行验证。基因组定位结果发现这９个ＳＷＥＥＴ基因分布在７条染色体上，蛋白序列可分成４个亚族。不同成员间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异；二级结构预测结果显示，这９个ＳＷＥＥＴ基因的氨基酸序列以α－螺旋和无规则卷曲为主要组成部分．．．

【目的】研究刺葡萄芪合酶(STS)基因的序列特征及其在不同光质处理下的表达水平，旨在为进一步解析STS基因通过响应光信号调控刺葡萄愈伤组织中白藜芦醇合成的分子机制提供依据。【方法】以刺葡萄愈伤组织为材料，利用逆转录PCR(RT-PCR)技术成功克隆获得了4个STS基因，对这些基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其在不同光质下和不同培养阶段的表达水平。【结果】成功地从刺葡萄愈伤组织中克隆获得了VdSTS5、VdSTS6、VdSTS20、VdSTS21共4个基因，均含1 179 bp完整开放阅读框(ORF),编码392个氨基酸残基，预测其编码的是亲水性、无信号肽的细胞质定位蛋白，磷酸化修饰主要发生在苏氨酸和丝氨酸位点上，蛋白质的二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成，STS与查尔酮合成酶(CHS)的蛋白质序列具有高度同源性。4个VdSTS的蛋白质序列在系统进化树上处于3个不同的大分支中，其中，VdSTS5与VdSTS21处在不同的分支中，而VdSTS6与VdSTS20聚在同一分支中，葡萄属不同种之间的STS蛋白质序列相似度高，推测其可能具有相同的功能。启动子顺式作用元件预测发现，4个VdSTS启动子含有多个光响应元件，还含有转录因子识别和作用元件、激素作用元件等。光质显著影响4个VdSTS的表达，在白光、红光、黄光和黑暗处理下，VdSTS的总体表达水平较高，而在绿光和紫光处理下，VdSTS的总体表达水平较低；同时，VdSTS对不同光质的响应不仅存在着基因间的差异，还存在不同培养阶段的差异，VdSTS5在培养后期强烈响应黄光的调控，VdSTS6、VdSTS20在培养中期对黑暗和红光的响应最强，VdSTS21则在培养中期强烈响应红光的调控，这些基因表达水平的变化影响着刺葡萄愈伤组织中白藜芦醇的合成。【结论】4个VdSTS对光质的响应存在差异，可能在响应不同光质调控中对刺葡萄愈伤组织白藜芦醇的合成起到重要作用。

通过分析绵羊不同直径腔卵泡中葡萄糖与生殖激素(FSH、LH和17β-E_2)含量和相关受体基因表达的相关性,阐明不同腔卵泡发育中葡萄糖和生殖激素对卵泡生殖调控的机制。根据绵羊腔卵泡不同直径划分为小卵泡组(2.0～3.4 mm)、中卵泡组(3.5～5.4 mm)和大卵泡组(>5.5 mm)3组,收集其卵泡液及颗粒细胞(GCs)。采用AnnextinV-FITC测定小、中和大卵泡中GCs凋亡情况;利用放射免疫法检测小、中和大卵泡组中葡萄糖浓度及FSH、LH和17β-E_2的含量;运用qRT-PCR技术检测小、中和大卵泡GCs中FSHR、LHR和G6Pase基因的转录水平。结果显示,不同直径绵羊腔卵泡中GCs凋亡无显著差异(P>0.05);随着腔卵泡直径的增大,卵泡液中葡萄糖浓度、FSH、LH和17β-E_2的含量均升高;同时,GCs上FSHR、LHR、G6Pase基因的转录水平极显著升高(P<0.01)。不同直径腔卵泡中,葡萄糖浓度与FSH含量均呈显著正相关,仅在大卵泡中与LH呈显著正相关(P<0.05)。另外,葡萄糖浓度与FSHR、G6Pase基因的表达量呈显著正相关,只在大卵泡中与LHR表达量呈显著正相关(P<0.05)。随着绵羊腔卵泡生长,葡萄糖与生殖激素含量和相关受体基因表达量具有显著相关性,共同参与调节卵泡发育。

为探究6-BA对葡萄果实中有机酸积累的影响,及其调控果实有机酸合成的分子机制,以里扎马特葡萄为试材,花前5 d、花后3 d和花后10 d连续3次对花序与果穗进行6-BA处理,研究6-BA对葡萄果实中有机酸积累及其代谢相关基因表达的影响。结果表明,成熟果实中有机酸含量与6-BA处理浓度密切相关,30 mg/L处理后,成熟果实中的酒石酸和总酸含量均显著低于对照,但对苹果酸、柠檬酸和草酸含量并未产生较大影响;对于10,20 mg/L 6-BA处理而言,处理与对照成熟果实中的各种有机酸含量均不存在显著差异。基因表

为探究外源GA_3和PBZ处理对黄水蜜桃新梢生长及赤霉素合成代谢和信号转导途径相关基因表达的影响。对1年生黄水蜜桃枝条进行外源GA_3和PBZ喷施处理,测定新梢生长量,并利用qRT-PCR对GA合成代谢和信号传导途径中8个相关基因的表达量进行测定。结果表明:外源GA_3处理后新梢净生长量在处理8 d时显著高于对照,GA合成代谢相关基因KO和GA3-ox的表达量呈现出处理前期先升高后降低,处理后期逐渐升高的趋势,而GA信号转导相关基因DELLA、GID1c、SLY1的表达量呈现出在处理前期受抑制,后期迅速升高的趋势,且在处理后14 d时表达量达到峰值;外源PBZ处理后新梢净生长量在多个时期显著低于对照,并在处理后17 d时达极显著水平,GA合成代谢相关基因KO、GA20-ox、GA2-ox的表达量在整个处理过程中呈现出先逐渐升高随后降低的趋势,而GA3-ox基因在处理后整个时期近乎不表达,GA信号转导相关基因DELLA、GID1c、SLY1、ERF11的表达量在整个处理过程中均略低于对照,推测PBZ处理在转录水平上通过抑制活性GA的合成进而影响GA信号转导途径相关基因的表达来调节植物生长;外源GA_3逆转处理能显著解除PBZ对植物生长的抑制作用,且信号转导相关基因GID1c的表达量呈现出先升高后降低的趋势,DELLA基因的表达呈现出大多时期被抑制的情况。

克隆与肥城桃成熟有关的乙烯受体ETR1基因片段,优化ETR1的表达条件,获得ETR1重组蛋白,为进一步研究ETR1功能并改善肥城桃贮运性能奠定基础。以肥城桃成熟果实总RNA反转录cDNA为模板,经PCR扩增得到特异片段,将该片段连接到质粒,经双酶切后,连接至质粒并转染至表达载体,IPTG诱导,优化表达条件。并以cD-NA为模板,进行实时荧光定量PCR,测定外源NO对ETR1相对表达量的影响。序列分析结果表明,该序列与Gen-Bank中的AF124527的cDNA序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%。优化蛋白表达条件为:IPTG最佳浓度为0.5 mmol/L,最适温度为30℃,最适诱导时...

[目的]鉴定葡萄miR396家族成员（VvmiR396s）及其靶基因VvGRF1，探究VvmiR396s-VvGRF1在种子败育/发育中的作用模式。[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396s及其靶基因，生物信息学分析其潜在功能与进化保守性，RT-qPCR 检测VvmiR396s在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396s-VvGRF相关性差异。[结果]与‘魏可’葡萄相比，‘京可晶’葡萄花后28 d种子发育被严重抑制，出现败育且种子萎缩，而前者种子正常发育。对VvmiR396a/b/c/d 的前体及其成熟体序列进行鉴定，VvmiR396a/b/c/d前体均可形成典型的茎环结构，成熟体序列均位于茎环的5′臂上。VvmiR396a/b/c/d 与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近，而与小麦的亲缘关系较远。预测到VvmiR396s的8条潜在靶基因，利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1/10是VvmiR396s的真实靶基因，且后者对前两者的裂解位点及频度分别为10~(th)(19/22、5/25)/11~(th )(2/22、2/25)和9~(th)(17/21、3/20)/11~(th)(2/21、1/20)；进一步利用烟草共转化体系对它们的裂解作用进行了活体验证，并发现VvmiR396s对VvGRF1的裂解作用强于VvGRF10，故在此重点研究其对VvGRF1的作用。靶基因VvGRF1蛋白与胡杨、毛白杨、荷花、烟草等物种的亲缘关系较近，且不同物种的GRF1均含有QLQ、WRC两个结构域；VvMIR396s和VvGRF1的启动子上都有多种激素（生长素、赤霉素、脱落酸等）响应元件，说明其可能通过响应激素信号从而调控生长发育；定量结果发现，在‘京可晶’种子败育过程中，VvmiR396a/b/c/d的表达量逐渐升高，且在败育关键期（花后42 d）有最高表达，而VvGRF1呈现相反表达模式；而在有核品种‘魏可’种子发育中，VvmiR396s呈现下降的趋势，在花后42 d有最低表达，靶基因表现相反的表达模式，表明VvmiR396s可能介导VvGRF1正调控葡萄种子败育，而负调控种子的发育；进一步相关性分析发现，‘京可晶’种子败育中VvmiR396b与VvGRF1的负相关性最高，表明VvmiR396b对VvGRF1具有最强的负调控作用，且VvmiR396b-VvGRF1可能是葡萄种子败育的主要调控模块。[结论]在假单性结实葡萄‘京可晶’中，鉴定到VvmiR396a/b/c/d 4个成员；VvmiR396b-VvGRF1可能是参与调控葡萄种胚败育的调控途径。

【目的】克隆山葡萄(Vitis amurensis)CBF1转录因子基因(VaCBF1),为其功能的深入研究及其在植物抗寒基因工程中的应用奠定基础。【方法】根据植物CBF基因AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,利用PCR法从山葡萄cDNA中扩增VaCBF1基因的中间片段。再根据中间片段区域设计2对特异引物,采用反向PCR法扩增VaCBF1基因的5′端和3′端序列。将中间片段与5′端和3′端序列拼接后得到山葡萄VaCBF1基因的cDNA全长序列,据此设计1对特异引物,PCR扩增VaCBF1基因编码区的全长序列,并对其进行生物信息学分析。同时,利用荧光定量PCR分析山葡萄VaCBF1基因在不...

【目的】克隆葡萄风信子MYB转录因子基因(MaMYB1),并对其进行生物信息学和表达模式的分析。【方法】以开蓝色花的葡萄风信子品种"亚美尼亚"为材料,利用RACE技术得到其MaMYB1基因cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用酵母单杂交方法检测其转录激活活性,并用实时定量PCR方法分析该基因在根、茎、叶及不同发育时期花中的表达特性。【结果】通过RACE-PCR,克隆得到953bp的MaMYB1基因,其开放阅读框长750bp,编码249个氨基酸,推测的蛋白分子质量约为27.7ku,理论等电点为9.3。MaMYB1基因编码的蛋白序列中具有2个典型的MYB结构域R2和R3,且在R3结构域下游含有...